Materiais vexetais e patóxenos
O doutor Pat Brown da Universidade de Illinois (agora na UC Davis) proporcionou unha poboación de cartografía de asociación de sorgo coñecida como poboación de conversión de sorgo (SCP).Describiuse anteriormente e é unha colección de liñas diversas convertidas en insensibilidade ao fotoperíodo e menor estatura para facilitar o crecemento e desenvolvemento das plantas en ambientes estadounidenses.Neste estudo utilizáronse 510 liñas desta poboación aínda que debido á mala xerminación e outros problemas de control de calidade, non todas as liñas foron utilizadas na análise dos tres trazos.Finalmente utilizáronse datos de 345 liñas para a análise da resposta de quitina, 472 liñas para a resposta flg22 e 456 para a resistencia TLS.B. cookeia cepa LSLP18 foi obtida do doutor Burt Bluhm da Universidade de Arkansas.
Medición de resposta MAMP
Neste estudo empregáronse dous MAMP diferentes, flg22 (catalogo Genscript # RP19986) e quitina.As plantas de sorgo cultiváronse en insercións colocadas en pisos cheos de chan (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) no invernadoiro.As plantas regáronse o día anterior á recollida de mostras para evitar a humidade extra das follas o día da recollida.
As liñas foron aleatorias e, por razóns loxísticas, plantáronse en lotes de 60 liñas.Para cada liña plantáronse tres "macetas" con dúas sementes por liña.Os lotes posteriores plantáronse en canto se procesara o lote anterior ata avaliar toda a poboación.Realizáronse dúas carreiras experimentais para ambos os MAMP con xenotipos re-aleatorizados en cada unha das dúas carreiras.
Os ensaios de ROS realizáronse como se describiu anteriormente.Brevemente, para cada liña plantáronse seis sementes en 3 macetas diferentes.Das mudas resultantes, seleccionáronse tres en función da uniformidade.Non se utilizaron mudas que parecían pouco comúns ou eran significativamente máis altas ou máis curtas que a maioría.Cortáronse catro discos de follas de 3 mm de diámetro da parte máis ancha da cuarta folla de tres plantas diferentes de sorgo de 15 días.Un disco por folla de dúas plantas e dous discos dunha planta, co segundo disco converténdose no control da auga (ver máis abaixo).Os discos flotaron individualmente sobre 50 µl de H20 nunha placa negra de 96 pocillos, seláronse cun selo de aluminio para evitar a exposición á luz e mantivéronse a temperatura ambiente durante a noite.Á mañá seguinte preparouse unha solución de reacción usando sonda quimioluminiscente L-012 de 2 mg/ml (Wako, número de catálogo 120-04891), peroxidase de rábano picante 2 mg/ml (Tipo VI-A, Sigma-Aldrich, número de catálogo P6782) e 100 mg/ml de quitina ou 2 μM de Flg22.Engadíronse 50 µl desta solución de reacción a tres dos catro pozos.O cuarto pozo foi un simulacro de control, ao que se lle engadiu a solución de reacción excluíndo o MAMP.En cada placa tamén se incluíron catro pozos en branco que só conteñen auga.
Despois de engadir a solución de reacción, a luminiscencia foi medida usando o lector de microplacas de detección múltiple SynergyTM 2 (BioTek) cada 2 minutos durante 1 hora.O lector de placas realiza medicións de luminiscencia cada 2 min durante esta 1 h.Calculouse a suma das 31 lecturas para dar o valor de cada pozo.O valor estimado para a resposta de MAMP para cada xenotipo calculouse como (valor medio de luminiscencia dos tres pozos experimentais, o valor do pozo simulado) menos o valor medio do pozo en branco.Os valores do pozo en branco foron constantemente próximos a cero.
Discos de follas deNicotiana benthamiana, unha liña de sorgo de alta resposta (SC0003) e unha liña de sorgo de baixa resposta (PI 6069) tamén se incluíron como controis en cada placa de 96 pozos para fins de control de calidade.
B. cookeipreparación e inoculación do inóculo
B. cookeipreparouse o inóculo como se describiu anteriormente.Brevemente, os grans de sorgo foron empapados en auga durante tres días, enxágües, envasados en frascos cónicos de 1 litro e autoclavados durante unha hora a 15 psi e 121 °C.A continuación, inocularon os grans cuns 5 ml de micelio macerado procedente dun cultivo fresco deB. cookeiIllado LSLP18 e deixado durante 2 semanas a temperatura ambiente, axitando os matraces cada 3 días.Despois de 2 semanas, os grans de sorgo infestados por fungos secáronse ao aire e despois almacenáronse a 4 °C ata a inoculación no campo.Utilizouse o mesmo inóculo durante todo o ensaio e fíxose fresco todos os anos.Para a inoculación, colocáronse 6-10 grans infestados no verticilo de plantas de sorgo de 4-5 semanas.As esporas producidas a partir destes fungos iniciaron a infección nas plantas novas de sorgo nunha semana.
Preparación de sementes
Antes de plantar no campo, a semente de sorgo foi tratada cunha mestura de funxicida, insecticida e protector que contiña ~ 1% de funxicida Spirato 480 FS, 4% de funxicida Sebring 480 FS, 3% de protector de sementes Sorpro 940 ES.A continuación, as sementes secáronse ao aire durante 3 días, o que proporcionou unha fina capa desta mestura ao redor das sementes.O protector permitiu o uso do herbicida Dual Magnum como tratamento de pre-emerxencia.
Avaliación da resistencia á mancha foliar obxectivo
O SCP plantouse na Central Crops Research Station en Clayton, Carolina do Norte, entre o 14 e o 15 de xuño de 2017 e o 20 de xuño de 2018 nun deseño de bloques completos aleatorios con dúas réplicas experimentais en cada caso.Os experimentos plantáronse en filas únicas de 1,8 m cun ancho de fila de 0,9 m utilizando 10 sementes por parcela.Plantáronse dúas filas de lindeiras arredor da periferia de cada experimento para evitar os efectos de bordo.Os experimentos foron inoculados o 20 de xullo de 2017 e o 20 de xullo de 2018, momento no que as plantas de sorgo estaban na fase de crecemento 3. As valoracións foron tomadas nunha escala de un a nove, onde as plantas que non mostraban signos de enfermidade foron puntuadas como nove e completamente. as plantas mortas foron puntuadas como unha.Realizáronse dúas valoracións en 2017 e catro lecturas en 2018 a partir de dúas semanas despois da inoculación cada ano.sAUDPC (área estandarizada baixo a curva de progresión da enfermidade) calculouse como se describiu anteriormente.
Hora de publicación: 01-Abr-2021