Materiais vexetais e patóxenos
O Dr. Pat Brown, da Universidade de Illinois (agora na UC Davis), proporcionou unha poboación de mapeo de asociación de sorgo coñecida como poboación de conversión de sorgo (SCP). Xa foi descrita previamente e é unha colección de liñas diversas convertidas a insensibilidade ao fotoperíodo e menor estatura para facilitar o crecemento e desenvolvemento das plantas en ambientes estadounidenses. Neste estudo empregáronse 510 liñas desta poboación, aínda que debido á mala xerminación e outros problemas de control de calidade, non se empregaron todas as liñas na análise dos tres trazos. Finalmente, empregáronse datos de 345 liñas para a análise da resposta á quitina, 472 liñas para a resposta a flg22 e 456 para a resistencia a TLS.B. cookeiA cepa LSLP18 obtívose do Dr. Burt Bluhm da Universidade de Arkansas.
Medición da resposta MAMP
Neste estudo empregáronse dous MAMP diferentes flg22, (catálogo Genscript n.º RP19986) e quitina. As plantas de sorgo cultiváronse en insercións colocadas sobre superficies planas cheas de terra (33 % de mestura de cultivo Sunshine Redi-Earth Pro) no invernadoiro. As plantas regáronse o día antes da recollida da mostra para evitar humidade adicional das follas o día da recollida.
As liñas foron aleatorizadas e, por razóns loxísticas, plantáronse en lotes de 60 liñas. Para cada liña, plantáronse tres "macetas" con dúas sementes por liña. Os lotes posteriores plantáronse en canto se procesou o lote anterior ata que se avaliou toda a poboación. Realizáronse dúas execucións experimentais para ambos os MAMP con xenotipos re-aleatorizados en cada unha das dúas execucións.
Os ensaios de ROS realizáronse como se describiu anteriormente. En resumo, para cada liña plantáronse seis sementes en 3 macetas diferentes. Das plántulas resultantes, seleccionáronse tres en función da uniformidade. Non se utilizaron as plántulas que parecían pouco comúns ou que eran significativamente máis altas ou máis baixas que a maioría. Excisáronse catro discos de follas de 3 mm de diámetro da parte máis ancha da 4ª folla de tres plantas de sorgo diferentes de 15 días de idade. Un disco por folla de dúas plantas e dous discos dunha planta, sendo o segundo disco o control de auga (ver máis abaixo). Os discos flotaron individualmente en 50 µl de H20 nunha placa negra de 96 pozos, seláronse cun selo de aluminio para evitar a exposición á luz e mantivéronse a temperatura ambiente durante a noite. Á mañá seguinte, preparouse unha solución de reacción usando unha sonda quimioluminiscente L-012 (Wako, catálogo nº 120-04891) a 2 mg/ml, peroxidase de ravo picante a 2 mg/ml (tipo VI-A, Sigma-Aldrich, catálogo nº P6782) e quitina a 100 mg/ml ou 2 μM de Flg22. Engadíronse 50 µl desta solución de reacción a tres dos catro pozos. O cuarto pozo foi un control simulado, ao que se lle engadiu a solución de reacción sen o MAMP. Tamén se incluíron catro pozos en branco que contiñan só auga en cada placa.
Despois de engadir a solución de reacción, a luminescencia mediuse cun lector de microplacas multidetección Synergy™ 2 (BioTek) cada 2 minutos durante 1 hora. O lector de placas realiza medicións de luminescencia cada 2 minutos durante esta hora. Calculouse a suma das 31 lecturas para obter o valor de cada pozo. O valor estimado da resposta MAMP para cada xenotipo calculouse como (valor medio de luminescencia dos tres pozos experimentais (o valor do pozo simulado) menos o valor medio do pozo en branco. Os valores do pozo en branco estiveron consistentemente próximos a cero.
Discos de follas deNicotiana benthamiana, tamén se incluíron como controis en cada placa de 96 pozos con fins de control de calidade unha liña de sorgo de alta resposta (SC0003) e unha liña de sorgo de baixa resposta (PI 6069).
B. cookeipreparación e inoculación do inóculo
B. cookeiO inóculo preparouse como se describiu anteriormente. En resumo, os grans de sorgo foron mergullados en auga durante tres días, enxaugados, colocados en matraces cónicos de 1 L e esterilizados en autoclave durante unha hora a 15 psi e 121 °C. Despois, os grans foron inoculados con aproximadamente 5 ml de micelios macerados dun cultivo fresco deB. cookeiIllados de LSLP18 e deixáronse durante 2 semanas a temperatura ambiente, axitando os frascos cada 3 días. Despois de 2 semanas, os grans de sorgo infestados por fungos secáronse ao aire e logo almacenáronse a 4 °C ata a inoculación no campo. O mesmo inóculo utilizouse para todo o ensaio e preparouse fresco cada ano. Para a inoculación, colocáronse de 6 a 10 grans infestados na verticila de plantas de sorgo de 4 a 5 semanas de idade. As esporas producidas por estes fungos iniciaron a infección nas plantas de sorgo novas nunha semana.
Preparación de sementes
Antes de plantar no campo, as sementes de sorgo foron tratadas cunha mestura de funxicida, insecticida e protector contra a sementeira que contiña ~1 % de funxicida Spirato 480 FS, 4 % de funxicida Sebring 480 FS e 3 % de protector contra a sementeira Sorpro 940 ES. Despois, as sementes secáronse ao aire durante 3 días, o que proporcionou unha capa fina desta mestura arredor das sementes. O protector permitiu o uso do herbicida Dual Magnum como tratamento de preemerxencia.
Avaliación da resistencia á mancha foliar obxectivo
O SCP plantouse na Estación Central de Investigación de Cultivos en Clayton, Carolina do Norte, os días 14 e 15 de xuño de 2017 e 20 de xuño de 2018 nun deseño de bloques completos aleatorios con dúas repeticións experimentais en cada caso. Os experimentos plantáronse en fileiras individuais de 1,8 m cunha anchura de fileira de 0,9 m usando 10 sementes por parcela. Plantáronse dúas fileiras de bordo arredor da periferia de cada experimento para evitar efectos de bordo. Os experimentos inoculáronse o 20 de xullo de 2017 e o 20 de xullo de 2018, momento no que as plantas de sorgo estaban na fase de crecemento 3. As cualificacións realizáronse en escalas de un a nove, onde as plantas que non mostraban signos de enfermidades puntuáronse cun nove e as plantas completamente mortas cun un. Realizáronse dúas cualificacións en 2017 e catro lecturas en 2018, comezando dúas semanas despois da inoculación cada ano. A sAUDPC (área estandarizada baixo a curva de progresión da enfermidade) calculouse como se describiu anteriormente.
Data de publicación: 01-04-2021