Os pesticidas desempeñan un papel fundamental na loita contra a escaseza mundial de alimentos e na loita contra as enfermidades humanas transmitidas por vectores. Non obstante, o crecente problema da resistencia aos pesticidas require urxentemente o descubrimento de novos compostos que se dirixan a obxectivos infrautilizados. Os canais potenciais do receptor transitorio de insectos (TRPV), Nanzhong (Nan) e inactivos (Iav), poden formar canais heterólogos (Nan-Iav) e localizarse en órganos mecanosensoriais que median o xeotropismo, a audición e a propiocepción nos insectos. Algúns pesticidas, como a afidopirrolidona (AP), diríxense a Nan-Iav a través de mecanismos descoñecidos. A AP é eficaz contra os insectos que perforan e chupan (hemípteros), o que impide a alimentación ao interromper a función dos filamentos. A AP só pode unirse a Nan, pero só a Nan-Iav pode interactuar con agonistas, incluída a nicotinamida endóxena (NAM), mostrando así actividade de canle. A pesar do potencial de Nan-Iav como obxectivo de insecticidas, sábese pouco sobre o seu ensamblaxe de canais, os seus sitios de unión reguladores e a súa regulación dependente do Ca2+, o que dificulta un maior desenvolvemento de insecticidas. Neste estudo, empregouse a criomicroscopía electrónica para determinar a estrutura de Nan-Iav en insectos Hemiptera no estado libre de ligando de calmodulina, así como con AP e NAM no límite do dominio citoplasmático de repetición de anquirina (ARD). Sorprendentemente, descubrimos que a propia proteína Nan pode formar un pentámero, que se estabiliza mediante interaccións ARD mediadas por AP. Este estudo revela interaccións moleculares entre insecticidas e agonistas e Nan-Iav, destacando a importancia de ARD na función e ensamblaxe dos canais, e explorando o mecanismo de regulación do Ca2+.
No contexto dun cambio climático global cada vez máis severo, o deterioro da seguridade alimentaria mundial é un dos principais desafíos do século XXI, con consecuencias en cascada para a sociedade.1,2O informe sobre o estado da seguridade alimentaria e a nutrición no mundo 2023 (SOFI) da Organización Mundial da Saúde estima que aproximadamente 2.330 millóns de persoas en todo o mundo padecen inseguridade alimentaria de moderada a grave, un problema de longa data.3,4Desafortunadamente, estímase que entre o 20 % e o 30 % ou máis da colleita pérdese anualmente por mor de pragas e patóxenos, e espérase que o quecemento global exacerbe a resistencia ás pragas e a vulnerabilidade dos cultivos.4, 5, 6, 7, 8O desenvolvemento de pesticidas é fundamental non só para protexer os cultivos das pragas e reducir a propagación de patóxenos transmitidos por vectores, senón tamén para combater as enfermidades humanas transmitidas por vectores, como a dengue, a malaria e a enfermidade de Chagas, que son cada vez máis resistentes aos pesticidas.5, 9, 10, 11
Entre os principais obxectivos dos insecticidas neurotóxicos, o canal heterotetramérico TRPV Nanchung (Nan)-Inactivo (Iav) representa unha clase de obxectivos de insecticidas descubertos só na última década, incluíndo insecticidas dispoñibles comercialmente como o imidacloprid e a piraclostrobina.12, 13, 14O insecticida semisintético afidopirrolifeno (AP) é un produto desenvolvido e comercializado recentemente cuxo compoñente principal é o insecticida activo Inscalis®, que se une á AP a un nivel de actividade subnanomolar.15O AP presenta unha baixa toxicidade aguda para os polinizadores, insectos beneficiosos e outros organismos non obxectivo e, cando se usa segundo as instrucións da etiqueta, pode reducir a presión de resistencia a outros insecticidas.16, 17, 18Nan e Iav están amplamente distribuídos entre as especies de insectos, coexprésanse só nas neuronas receptoras de estiramento cordal das antenas e as extremidades, e son fundamentais para a audición, a percepción da gravidade e a propiocepción.13, 16, 19, 20, 21, 22A AP, o imidacloprid e a piraclostrobina estimulan o complexo Nan-Iav a través dun mecanismo único, inhibindo en última instancia a transdución de sinais propioceptivos.13, 16, 23Nos insectos hemípteros, como os pulgóns e as moscas brancas, a perda da propiocepción prexudica a súa capacidade de alimentación, o que finalmente lles provoca a morte.13,24Curiosamente, a AP presenta unha alta afinidade polo complexo Nan-Iav e baixa afinidade pola Nan soa. A unión da AP á Nan-Iav induce unha corrente eléctrica, pero a unión á Nan soa non estimula a actividade do canal. A Iav en si non se une á AP en absoluto.16Isto suxire que a Nan e a Iav poden unirse para formar diferentes complexos de canais Nan-Iav (por exemplo, con diferentes proporcións estequiométricas ou diferentes arranxos dentro da mesma proporción estequiométrica) ou que a AP pode unirse a múltiples sitios. Ademais, o agonista natural nicotinamida (NAM) únese á Nan-Iav de Drosophila con afinidade micromolar, mostrando efectos similares aos dos pulgóns (AP) in vitro.16,25e inhibindo a reprodución e a alimentación dos pulgóns, o que en última instancia leva á súa morte25,26Estes datos suscitan moitas preguntas. Por exemplo, segue sen estar claro como se forma o heterodímero Nan-Iav, que sitios de unión se usan para modular pequenas moléculas e como estas pequenas moléculas regulan a función do canal suprimindo a propiocepción. Ademais, seguen sen estar claras as razóns polas que a propia Nan é inactiva e ten baixa afinidade pola AP, mentres que o heterodímero Nan-Iav é activo e únese á AP con maior afinidade. Finalmente, sábese pouco sobre a regulación dependente do Ca2+ da función Nan-Iav e como se integra nos procesos de sinalización neuronal.13,21
Neste estudo, combinando criomicroscopía electrónica, electrofisioloxía e técnicas de unión a radioligandos, dilucidamos o ensamblaxe de Nan-Iav e o mecanismo da súa unión a reguladores de pequenas moléculas. Ademais, detectamos calmodulina (CaM) unida constitutivamente a Iav e pentámeros Nan estabilizados con AP. Estes resultados proporcionan información importante sobre a regulación dos ións de calcio nos canais, o ensamblaxe dos canais e os factores que determinan a afinidade de unión ao ligando. Máis importante aínda, confirmamos que a ARD xoga un papel central nestes procesos. O noso estudo de canais completos de insectos unidos a pesticidas agrícolas relevantes27, 28, 29abre perspectivas para o desenvolvemento da industria dos pesticidas, mellorando a súa eficacia e especificidade e permitindo a aplicación de compostos dirixidos ao TRPV a outras especies para abordar a seguridade alimentaria mundial e a propagación de enfermidades transmitidas por vectores.
Tamén descubrimos que o Nan-Iav está regulado polo Ca2+ e que o mecanismo de regulación está mediado polo CaM unido constitutivamente. É importante destacar que esta regulación dependente do Ca2+ do Nav polo CaM difire significativamente dos mecanismos de regulación doutros canais iónicos (por exemplo, os canais de Na+ regulados por voltaxe e os canais TRPV5/6).52, 53, 54, 55, 56, 57No canal Nav1.2, o dominio C-terminal de CaM asóciase helicoidalmente co dominio C-terminal (CTD) e o Ca2+ induce a unión do seu dominio N-terminal á porción distal do CTD.56No canal TRPV5/6, o dominio C-terminal de CaM únese a CTH e o Ca2+ induce a extensión cara arriba do seu dominio N-terminal cara ao interior do poro, bloqueando así a permeabilidade catiónica.53,54Propoñemos un modelo para a función regulada por Ca2+ de Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). Neste modelo, o dominio N-terminal de CaM únese constitutivamente ao dominio C-terminal (CTH) de Iav. No estado de repouso (baixa concentración de [Ca2+]), o dominio C-terminal de CaM interactúa con Nan, estabilizando a conformación da ARD e promovendo así a apertura do canal. A unión dun agonista/insecticida ao canal induce a apertura dos poros, o que leva ao influxo de Ca2+. O Ca2+ únese entón a CaM, causando a disociación do dominio C-terminal da ARD de Nan. Dado que o bloqueo da unión de CaM esencialmente elimina o efecto inhibitorio do Ca2+, esta disociación modula a mobilidade da ARD, causando así unha inhibición ou desensibilización dependente de Ca2+. A rápida recuperación das correntes do canal despois da elución de ións de calcio (Fig. 4g) suxire que este mecanismo facilita respostas rápidas aos sinais neuronais mediados por Ca2+. Ademais, informouse de que a rexión C-terminal de Iav, que aínda non se coñece ben, desempeña outros papeis na orientación dos canais e na regulación actual.21
Finalmente, o noso estudo presenta a estrutura de alta resolución dun complexo de canles TRP insecticida-insecticida de importancia agrícola, un descubrimento que antes descoñecíamos. En particular, caracterizamos a estrutura e a función da canle do insecto en células humanas (HEK293S GnTi–) en lugar de en células de insectos. Ante a crecente resistencia aos insecticidas e a presión continua sobre a seguridade alimentaria e os patóxenos, o noso traballo proporciona información importante que facilitará o desenvolvemento de novos insecticidas en beneficio da saúde humana e a seguridade alimentaria mundial. Os estudos demostraron que os insecticidas como o AP son eficaces contra algunhas pragas cando se usan segundo as instrucións da etiqueta e teñen unha baixa toxicidade aguda para os polinizadores beneficiosos, o que demostra a súa seguridade ambiental.13,16Ademais, as probas con algúns derivados da PA en mosquitos demostraron que acaban perdendo a súa capacidade de voar. Comprender como estes compostos moduladores se unen a Nan-Iav facilitará a modificación dos compostos existentes ou o desenvolvemento de novos compostos para obter resultados máis eficaces e...precisocontrol de pragas. O noso estudo demostra que a interface Nan-Iav ARD é fundamental non só para regular a actividade de compostos endóxenos, pesticidas e Ca2+-CaM, senón tamén para a ensamblaxe de canais. Suxerimos que a interrupción da ensamblaxe de heterodímeros con pequenas moléculas pode ser unha estratexia única e prometedora para desenvolver inhibidores de canais iónicos.
Dos oito xenes ortólogos, seleccionáronse os xenes de lonxitude completa do escaravello marrón (Halyomorpha halys) Nanchung e Inactive, que mostran unha excelente estabilidade en deterxentes. Os xenes sintetizados optimizáronse en codóns para a expresión humana e clonáronse no vector pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) utilizando sitios de restrición XhoI e EcoRI. Isto garantiu que os clons estivesen no marco coas etiquetas C-terminais GFP-FLAG-10xHis e mCherry-FLAG-10xHis, que son clivadas pola protease HRC-3C (PPX), o que permite a autodetección independente.expresiónOs cebadores empregados para clonar Nanchung e Inactive no vector pBacMam foron os seguintes:
As imaxes microscópicas de partículas individuais obtivéronse nun microscopio electrónico de transmisión (FEI) Titan Krios G2 equipado cunha cámara K3 e un filtro de enerxía Gatan BioQuantum. O microscopio funcionou a 300 keV, cun axuste de enerxía de 20 eV, un tamaño de píxel da mostra de 1,08 Å/píxel (ampliación nominal de 81.000x) e un gradiente de desenfoque que oscilaba entre -0,8 e -2,2 μm. A gravación de vídeo realizouse a 40 fotogramas por segundo usando un microscopio Latitude S (Gatan) cunha taxa de dose nominal de 25 e–px−1 s−1, un tempo de exposición de 2,4 s e unha dose total de aproximadamente 60 e–Å−2.
A corrección do movemento inducido por feixe e a ponderación da dose realizáronse en película empregando MotionCor2 en RELION 4.061. A estimación do parámetro da función de transferencia de contraste (CTF) realizouse en cryoSPARC empregando o método de estimación CTF baseado en parches62. As microfotografías cunha resolución de axuste CTF ≥4 Å excluíronse da análise posterior. Normalmente, utilizouse un subconxunto de 500 a 1000 microfotografías para a selección de puntos en cryoSPARC, seguido de varias roldas de clasificación 2D despois do filtrado para obter unha imaxe de referencia clara para a selección de partículas baseada en modelos. Despois, as partículas extraéronse empregando caixas delimitadoras de 64 píxeles e agrupamento de 4 pregamentos. Realizáronse varias roldas de clasificación 2D para eliminar as categorías de partículas non desexadas. O modelo 3D inicial reconstruíuse empregando a reconstrución ab initio e refinouse empregando o refinamento non uniforme en cryoSPARC. A clasificación 3D realizouse en cryoSPARC ou RELION baseándose na heteroxeneidade ARD. Non se observou unha heteroxeneidade significativa dos dominios da membrana. As partículas refináronse empregando os métodos C1 e C2; As partículas con maior resolución de C2 consideráronse simétricas con respecto a C2 e importáronse a RELION para o seu refinamento bayesiano. Despois, as partículas transferíronse de volta a cryoSPARC para o seu refinamento final non uniforme e local. A resolución final e o reconto de partículas móstranse na Táboa 1.
Ao procesar pentámeros Nan+AP, exploramos varios métodos para mellorar a resolución dos dominios de membrana (especialmente a rexión dos poros), como a subtracción de sinais e o enmascaramento TMD. Non obstante, estes intentos non tiveron éxito debido á desorde potencialmente extrema na rexión dos poros e á heteroxeneidade xeral do TMD. A resolución final calculouse usando unha máscara xerada automaticamente polo método de procesamento non uniforme en cryoSPARC, dirixida principalmente á rexión ARD. Isto conseguiu unha resolución significativamente maior que a dos dominios de membrana (especialmente a rexión VSLD).
Os modelos iniciais de novo das formas apo dos insectos Nanchung e Inactive xeráronse primeiro usando Coot63, e os modelos dos insectos Nan e Iav xeráronse usando AlphaFold264 para identificar rexións de baixa confianza. A modelización da calmodulina baseouse en axustes de corpo ríxido dos modelos de unión a Ca2+ e libres de Ca2+ nas accesións de PDB 4JPZ56 e 1CFD65, respectivamente. Os modelos refináronse usando refinamento esférico para garantir a estereoquímica correcta e unha boa xeometría. A continuación, modeláronse a fosfatidilcolina, a fosfatidiletanolamina e a fosfatidilserina como densidades lipídicas ben definidas, e os ligandos NAM e AP colocáronse nas densidades correspondentes nas unións estreitas. Os ficheiros de restricións xeráronse a partir da cadea SMILES das isoformas usando eLBOW en PHENIX66. Finalmente, os modelos refináronse no espazo real en PHENIX usando a busca en cuadrícula local e a minimización global con restricións de estrutura secundaria. O servidor MolProbity empregouse para o refinamento do modelo e a análise estrutural, e as ilustracións realizáronse con PyMOL e UCSF Chimera X.67,68,69 A análise de apertura realizouse con o servidor HOLE,70 e o mapeo de conservación de secuencias realizouse con o servidor Consurf.71
A análise estatística realizouse empregando Igor Pro 6.2, Excel Office 365 e GraphPad Prism 7.0. Todos os datos cuantitativos preséntanse como media ± erro estándar (SEM). A proba t de Student (bilateral, non emparellada) utilizouse para comparar dous grupos. A análise unidireccional da varianza (ANOVA) seguida da proba post hoc de Dunnett utilizouse para comparar varios grupos. *P< 0,05, **P< 0,01 e ***PConsideráronse valores estatisticamente significativos os valores < 0,001 dependendo da distribución dos datos. Os valores de Kd e Ki e os seus intervalos de confianza asimétricos do 95 % calculáronse mediante GraphPad Prism 10.
Para obter máis detalles sobre a metodoloxía do estudo, consulta o Resumo do Informe de Portfolio de Natureza ao que se fai referencia neste artigo.
O modelo inicial construíuse empregando os modelos de calmodulina das bases de datos PDB 4JPZ e 1CFD. As coordenadas depositáronse no Protein Data Bank (PDB) cos números de acceso 9NVN (Nan-Iav-CaM sen ligando), 9NVO (Nan-Iav-CaM unido a nicotinamida), 9NVP (Nan-Iav-CaM unido a nicotinamida e EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM unido a afenidolpirrolina e calcio), 9NVR (Nan-Iav-CaM unido a afenidolpirrolina e EDTA) e 9NVS (pentámero Nan unido a afenidolpirrolina). As imaxes de criomicroscopía electrónica correspondentes están depositadas na base de datos de microscopía electrónica (EMDB) cos seguintes números de acceso: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM sen ligando), EMD-49845 (complexo Nan-Iav-CaM con nicotinamida), EMD-49846 (complexo Nan-Iav-CaM con nicotinamida e EDTA), EMD-49847 (complexo Nan-Iav-CaM con afidopirrolina e calcio), EMD-49848 (complexo Nan-Iav-CaM con afidopirrolina e EDTA) e EMD-49849 (complexo Nan pentámero con afidopirrolina). Os datos brutos para a análise funcional preséntanse neste artigo.
Data de publicación: 28 de xaneiro de 2026