O fármaco antihelmíntico N,N-dietil-m-toluamida (DEET) inhibe a AChE (acetilcolinesterase) e ten propiedades canceríxenas potenciais debido á vascularización excesiva. Neste artigo, demostramos que o DEET estimula especificamente as células endoteliais que promoven a anxioxénese, aumentando así o crecemento tumoral. O DEET activa os procesos celulares que levan á anxioxénese, incluíndo a proliferación, a migración e a adhesión. Isto está asociado a un aumento da produción de NO e da expresión de VEGF nas células endoteliais. O silenciamento de M3 ou o uso de inhibidores farmacolóxicos de M3 aboliu todos estes efectos, o que suxire que a anxioxénese inducida por DEET é sensible a M3. Os experimentos que implican a sinalización de calcio en células endoteliais e HEK que sobreexpresan receptores M3, así como os estudos de unión e acoplamento, indican que o DEET actúa como un modulador alostérico dos receptores M3. Ademais, o DEET inhibe a AChE, aumentando así a biodispoñibilidade da acetilcolina e a súa unión aos receptores M3 e mellorando os efectos proanxioxénicos a través da regulación alostérica.
As células endoteliais primarias illáronse da aorta de ratos Swiss. O método de extracción adaptouse do protocolo de Kobayashi 26. As células endoteliais murinas cultiváronse en medio EBM-2 suplementado con FBS inactivado por calor ao 5 % ata a cuarta pasaxe.
Analizouse o efecto de dúas concentracións de DEET na proliferación de HUVEC, U87MG ou BF16F10 empregando o kit de ensaio de proliferación celular CyQUANT (Molecular Probes, C7026). En resumo, sementáronse 5,103 células por pozo nunha placa de 96 pozos, deixáronse unirse durante a noite e logo tratáronse con DEET durante 24 h. Despois de retirar o medio de crecemento, engádese unha solución de unión ao colorante a cada pozo da microplaca e incubense as células a 37 °C durante 30 min. Os niveis de fluorescencia determináronse empregando un lector de microplacas multimodo Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemaña) equipado con filtros de excitación de 485 nm e filtros de emisión de 530 nm.
As HUVEC sementáronse en placas de 96 pozos cunha densidade de 10⁴ células por pozo. As células tratáronse con DEET durante 24 h. A viabilidade celular avaliouse mediante un ensaio colorimétrico MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Os valores de densidade óptica obtivéronse nun lector de microplacas multimodo (Mithras LB940) a unha lonxitude de onda de 570 nm.
Os efectos do DEET estudáronse mediante ensaios de anxioxénese in vitro. O tratamento con 10⁻⁸ M ou 10⁻⁵ M de DEET aumentou a formación de lonxitude capilar nas HUVEC (Fig. 1a, b, barras brancas). En comparación co grupo de control, o tratamento con concentracións de DEET que oscilaban entre 10⁻⁴ e 10⁻⁵ M mostrou que a lonxitude capilar alcanzou unha meseta a 10⁻⁸ M de DEET (Fig. suplementaria S2). Non se atopou ningunha diferenza significativa no efecto proanxioxénico in vitro das HUVEC tratadas con DEET no rango de concentración de 10⁻⁸ M e 10⁻⁵ M.
Para determinar o efecto do DEET na neovascularización, realizamos estudos de neovascularización in vivo. Despois de 14 días, os ratos aos que se lles inxectaron células endoteliais precultivadas con 10⁻⁸ M ou 10⁻⁵ M de DEET mostraron un aumento significativo no contido de hemoglobina (Fig. 1c, barras brancas).
Ademais, estudouse a neovascularización inducida por DEET en ratos portadores de xenoenxerto U87MG aos que se lles inxectou DEET diariamente (ip) a unha dose que se sabe que induce concentracións plasmáticas de 10⁻⁵ M, o que é normal en humanos expostos. en 23. Observáronse tumores detectables (é dicir, tumores >100 mm3) 14 días despois da inxección de células U87MG en ratos. No día 28, o crecemento tumoral mellorou significativamente nos ratos tratados con DEET en comparación cos ratos de control (Fig. 1d, cadrados). Ademais, a tinción con CD31 dos tumores mostrou que o DEET aumentou significativamente a área capilar pero non a densidade microvasal. (Fig. 1e–g).
Para determinar o papel dos receptores muscarínicos na proliferación inducida por DETA, empregouse 10-8 M ou 10-5 M de DETA en presenza de pFHHSiD (10-7 M, un antagonista selectivo do receptor M3). Tratamento de HUVEC. O pFHHSiD bloqueou completamente as propiedades proliferativas de DETA en todas as concentracións (Táboa 1).
Nestas condicións, tamén examinamos se o DEET aumentaría a lonxitude capilar nas células HUVEC. Do mesmo xeito, o pFHHSiD impediu significativamente a lonxitude capilar inducida por DEET (Fig. 1a, b, barras grises). Ademais, realizáronse experimentos similares con siRNA M3. Aínda que o siRNA de control non foi eficaz para promover a formación de capilares, o silenciamento do receptor muscarínico M3 aboliu a capacidade do DEET para aumentar a lonxitude capilar (Fig. 1a, b, barras negras).
Ademais, tanto a vascularización inducida por DEET 10-8 M ou 10-5 M in vitro como a neovascularización in vivo foron completamente bloqueadas por pFHHSiD (Fig. 1c, d, círculos). Estes resultados indican que o DEET promove a anxioxénese a través dunha vía sensible aos antagonistas selectivos do receptor M3 ou ao siRNA de M3.
A AChE é o diana molecular do DEET. Fármacos como o donepezilo, que actúan como inhibidores da AChE, poden estimular a anxioxénese das células endoteliais in vitro e en modelos de isquemia das extremidades posteriores de rato14. Probamos o efecto de dúas concentracións de DEET sobre a actividade encimática da AChE en HUVEC. As concentracións baixas (10-8 M) e altas (10-5 M) de DEET diminuíron a actividade da AChE endotelial en comparación coas condicións de control (Fig. 2).
Ambas as concentracións de DEET (10⁻⁸ M e 10⁻⁵ M) reduciron a actividade da acetilcolinesterase nas HUVEC. O BW284c51 (10⁻⁵ M) utilizouse como control para os inhibidores da acetilcolinesterase. Os resultados exprésanse como porcentaxe da actividade da AChE nas HUVEC tratadas coas dúas concentracións de DEET en comparación coas células tratadas con vehículo. Os valores exprésanse como media ± SEM de seis experimentos independentes. *p < 0,05 en comparación co control (proba de comparación múltiple de Kruskal-Wallis e Dunn).
O óxido nítrico (NO) está implicado no proceso anxioxénico 33, polo que se estudou a produción de NO en HUVEC estimuladas con DEET. A produción de NO endotelial tratada con DEET aumentou en comparación coas células de control, pero só alcanzou significación a unha dose de 10-8 M (Fig. 3c). Para determinar os cambios moleculares que controlan a produción de NO inducida por DEET, analizáronse a expresión e activación de eNOS mediante Western blot. Aínda que o tratamento con DEET non alterou a expresión de eNOS, aumentou significativamente a fosforilación de eNOS no seu sitio de activación (Ser-1177) mentres que diminuíu o seu sitio inhibitorio (Thr-495) en comparación coas células non tratadas na fosforilación de eNOS (Fig. 3d). Ademais, calculouse a proporción de eNOS fosforilada no sitio de activación e no sitio inhibitorio despois de normalizar a cantidade de eNOS fosforilada coa cantidade total de encima. Esta proporción aumentou significativamente nas HUVEC tratadas con cada concentración de DEET en comparación coas células non tratadas (Fig. 3d).
Finalmente, analizouse mediante Western blot a expresión de VEGF, un dos principais factores proanxioxénicos. O DEET aumentou significativamente a expresión de VEGF, mentres que o pFHHSiD bloqueou completamente esta expresión.
Dado que os efectos do DEET son sensibles tanto ao bloqueo farmacolóxico como á regulación á baixa dos receptores M3, probamos a hipótese de que o DEET podería mellorar a sinalización do calcio. Sorprendentemente, o DEET non conseguiu aumentar o calcio citoplasmático en HUVEC (datos non mostrados) e HEK/M3 (Fig. 4a, b) para ambas as concentracións empregadas.
Data de publicación: 30 de decembro de 2024