O medicamento antihelmíntico N,N-dietil-m-toluamida (DEET) inhibe a AChE (acetilcolinesterase) e ten propiedades canceríxenas potenciais debido á vascularización excesiva. Neste artigo, mostramos que o DEET estimula especificamente as células endoteliais que promoven a anxioxénese, aumentando así o crecemento do tumor. O DEET activa os procesos celulares que conducen á anxioxénese, incluíndo a proliferación, a migración e a adhesión. Isto está asociado ao aumento da produción de NO e da expresión de VEGF nas células endoteliais. O silenciamento de M3 ou o uso de inhibidores farmacolóxicos de M3 aboliron todos estes efectos, o que suxire que a anxioxénese inducida por DEET é sensible a M3. Experimentos que implican sinalización de calcio en células endoteliais e HEK que sobreexpresan receptores M3, así como estudos de unión e acoplamento, indican que o DEET actúa como un modulador alostérico dos receptores M3. Ademais, o DEET inhibe a AChE, aumentando así a biodisponibilidade da acetilcolina e a súa unión aos receptores M3, e potenciando os efectos proanxioxénicos mediante a regulación alostérica.
Illáronse as CE primarias da aorta de ratos suízos. O método de extracción foi adaptado do protocolo Kobayashi 26 . Os EC murinos cultiváronse en medio EBM-2 complementado cun 5% de FBS inactivado por calor ata o cuarto paso.
O efecto de dúas concentracións de DEET sobre a proliferación de HUVEC, U87MG ou BF16F10 analizouse mediante o CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Brevemente, sementáronse 5,103 células por pozo nunha placa de 96 pocillos, deixáronse unir durante a noite e despois tratáronse con DEET durante 24 h. Despois de eliminar o medio de crecemento, engade a solución de unión de colorante a cada pozo da microplaca e incube as células a 37 °C durante 30 min. Os niveis de fluorescencia determináronse mediante un lector de microplacas multimodo Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemaña) equipado con filtros de excitación de 485 nm e filtros de emisión de 530 nm.
HUVEC sementáronse en placas de 96 pozos cunha densidade de 104 células por pozo. As células foron tratadas con DEET durante 24 h. A viabilidade celular foi avaliada mediante un ensaio colorimétrico MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Os valores de densidade óptica obtivéronse nun lector de microplacas multimodo (Mithras LB940) a unha lonxitude de onda de 570 nm.
Os efectos do DEET foron estudados mediante ensaios de anxioxénese in vitro. O tratamento con DEET 10-8 M ou 10-5 M aumentou a formación de lonxitude capilar nos HUVEC (Fig. 1a, b, barras brancas). En comparación co grupo control, o tratamento con concentracións de DEET entre 10-14 e 10-5 M mostrou que a lonxitude capilar alcanzou unha meseta a 10-8 M DEET (figura complementaria S2). Non se atopou ningunha diferenza significativa no efecto proanxioxénico in vitro dos HUVEC tratados con DEET no intervalo de concentración de 10-8 M e 10-5 M.
Para determinar o efecto do DEET na neovascularización, realizamos estudos de neovascularización in vivo. Despois de 14 días, ratos inxectados con células endoteliais precultivadas con DEET 10-8 M ou 10-5 M mostraron un aumento significativo no contido de hemoglobina (Fig. 1c, barras brancas).
Ademais, estudouse a neovascularización inducida por DEET en ratos portadores de xenoinjertos U87MG aos que se lles inxectaba DEET diariamente (ip) a unha dose coñecida por inducir concentracións plasmáticas de 10-5 M, o que é normal en humanos expostos. en 23. Os tumores detectables (é dicir, tumores > 100 mm3) observáronse 14 días despois da inxección de células U87MG en ratos. No día 28, o crecemento do tumor foi significativamente mellorado nos ratos tratados con DEET en comparación cos ratos control (Fig. 1d, cadrados). Ademais, a tinción CD31 dos tumores mostrou que o DEET aumentou significativamente a área capilar pero non a densidade de microvasos. (Fig. 1e–g).
Para determinar o papel dos receptores muscarínicos na proliferación inducida por DETA, utilizouse 10-8 M ou 10-5 M DETA en presenza de pFHHSiD (10-7 M, un antagonista selectivo do receptor M3). Tratamento de HUVEC. pFHHSiD bloqueou completamente as propiedades proliferativas de DETA en todas as concentracións (táboa 1).
Nestas condicións, tamén examinamos se o DEET aumentaría a lonxitude capilar nas células HUVEC. Do mesmo xeito, pFHHSiD impediu significativamente a lonxitude capilar inducida por DEET (Fig. 1a, b, barras grises). Ademais, realizáronse experimentos similares con siRNA M3. Aínda que o siRNA de control non foi eficaz para promover a formación de capilares, o silenciamento do receptor muscarínico M3 aboliu a capacidade do DEET para aumentar a lonxitude dos capilares (Fig. 1a, b, barras negras).
Ademais, tanto a vascularización inducida por DEET de 10-8 M ou 10-5 M in vitro como a neovascularización in vivo foron completamente bloqueadas por pFHHSiD (Fig. 1c, d, círculos). Estes resultados indican que o DEET promove a anxioxénese a través dunha vía sensible aos antagonistas selectivos do receptor M3 ou siRNA M3.
AChE é a diana molecular do DEET. Fármacos como o donepezilo, que actúan como inhibidores da AChE, poden estimular a anxioxénese da EC in vitro e en modelos de isquemia de extremidades posteriores de rato14. Probamos o efecto de dúas concentracións de DEET sobre a actividade do encima AChE en HUVEC. As concentracións baixas (10-8 M) e altas (10-5 M) de DEET diminuíron a actividade de AChE endotelial en comparación coas condicións de control (Fig. 2).
Ambas as concentracións de DEET (10-8 M e 10-5 M) reduciron a actividade da acetilcolinesterasa no HUVEC. BW284c51 (10-5 M) utilizouse como control dos inhibidores da acetilcolinesterase. Os resultados exprésanse como porcentaxe de actividade de AChE no HUVEC tratado coas dúas concentracións de DEET en comparación coas células tratadas con vehículo. Os valores exprésanse como media ± SEM de seis experimentos independentes. *p < 0,05 en comparación co control (proba de comparación múltiple de Kruskal-Wallis e Dunn).
O óxido nítrico (NO) está implicado no proceso anxioxénico 33, polo tanto, estudouse a produción de NO en HUVEC estimulados por DEET. A produción de NO endotelial tratada con DEET aumentou en comparación coas células control, pero só alcanzou significación a unha dose de 10-8 M (Fig. 3c). Para determinar os cambios moleculares que controlan a produción de NO inducida por DEET, analizáronse a expresión e activación de eNOS mediante transferencia Western. Aínda que o tratamento con DEET non alterou a expresión de eNOS, aumentou significativamente a fosforilación de eNOS no seu sitio de activación (Ser-1177) mentres diminuíu o seu sitio inhibidor (Thr-495) en comparación coas células non tratadas na fosforilación de eNOS (Fig. 3d). Ademais, a proporción de eNOS fosforilados no sitio de activación e no sitio inhibitorio calculouse despois de normalizar a cantidade de eNOS fosforilado coa cantidade total de encima. Esta proporción aumentou significativamente nos HUVEC tratados con cada concentración de DEET en comparación coas células non tratadas (Fig. 3d).
Finalmente, a expresión de VEGF, un dos principais factores proanxioxénicos, analizouse mediante Western blot. O DEET aumentou significativamente a expresión de VEGF, mentres que pFHHSiD bloqueou completamente esta expresión.
Dado que os efectos do DEET son sensibles tanto ao bloqueo farmacolóxico como á baixa regulación dos receptores M3, probamos a hipótese de que o DEET podería mellorar a sinalización do calcio. Sorprendentemente, o DEET non logrou aumentar o calcio citoplásmico en HUVEC (datos non mostrados) e HEK/M3 (Fig. 4a, b) para ambas as concentracións utilizadas.
Hora de publicación: 30-12-2024