Neste estudo, os efectos estimulantes do tratamento combinado dereguladores do crecemento das plantasInvestigouse o efecto das nanopartículas de óxido de ferro (2,4-D e cinetina) e das nanopartículas de óxido de ferro (Fe₃O₄-NPs) sobre a morfoxénese in vitro e a produción de metabolitos secundarios en *Hypericum perforatum* L. O tratamento optimizado [2,4-D (0,5 mg/L) + cinetina (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] mellorou significativamente os parámetros de crecemento da planta: a altura da planta aumentou un 59,6 %, a lonxitude da raíz un 114,0 %, o número de xemas un 180,0 % e o peso fresco do calo un 198,3 % en comparación co grupo de control. Este tratamento combinado tamén mellorou a eficiencia da rexeneración (50,85 %) e aumentou o contido de hipericina un 66,6 %. A análise por GC-MS revelou altos contidos de hiperósido, β-patoleno e alcohol cetílico, que representan o 93,36 % da área total do pico, mentres que os contidos de compostos fenólicos e flavonoides totais aumentaron ata un 80,1 %. Estes resultados indican que os reguladores do crecemento vexetal (PGR) e as nanopartículas de Fe₃O₄ (NP de Fe₃O₄) exercen un efecto sinérxico ao estimular a organoxénese e a acumulación de compostos bioactivos, o que representa unha estratexia prometedora para a mellora biotecnolóxica das plantas medicinais.
A herba de San Xoán (Hypericum perforatum L.), tamén coñecida como herba de San Xoán, é unha planta herbácea perenne da familia das hipericáceas que ten valor económico.[1] Os seus compoñentes bioactivos potenciais inclúen taninos naturais, xantonas, floroglucinol, naftalenodiantrona (hiperina e pseudohiperina), flavonoides, ácidos fenólicos e aceites esenciais.[2,3,4] A herba de San Xoán pódese propagar por métodos tradicionais; non obstante, a estacionalidade dos métodos tradicionais, a baixa xerminación das sementes e a susceptibilidade ás enfermidades limitan o seu potencial para o cultivo a grande escala e a formación continua de metabolitos secundarios.[1,5,6]
Polo tanto, o cultivo de tecidos in vitro considérase un método eficaz para a propagación rápida das plantas, a conservación dos recursos de xermoplasma e o aumento do rendemento de compostos medicinais [7, 8]. Os reguladores do crecemento das plantas (RCP) desempeñan un papel crucial na regulación da morfoxénese e son necesarios para o cultivo in vitro de calos e organismos enteiros. A optimización das súas concentracións e combinacións é crucial para a realización con éxito destes procesos de desenvolvemento [9]. Polo tanto, comprender a composición e a concentración axeitadas dos reguladores é importante para mellorar o crecemento e a capacidade rexenerativa da herba de San Xoán (H. perforatum) [10].
As nanopartículas de óxido de ferro (Fe₃O₄) son unha clase de nanopartículas que foron ou están a ser desenvolvidas para o cultivo de tecidos. O Fe₃O₄ ten propiedades magnéticas significativas, boa biocompatibilidade e a capacidade de promover o crecemento das plantas e reducir o estrés ambiental, polo que atraeu unha atención considerable nos deseños de cultivos de tecidos. As aplicacións potenciais destas nanopartículas poden incluír a optimización do cultivo in vitro para promover a división celular, mellorar a absorción de nutrientes e activar encimas antioxidantes [11].
Aínda que as nanopartículas demostraron bos efectos promotores do crecemento das plantas, os estudos sobre a aplicación combinada de nanopartículas de Fe₃O₄ e reguladores de crecemento vexetal optimizados en *H. perforatum* seguen sendo escasos. Para cubrir esta lagoa de coñecemento, este estudo avaliou os efectos dos seus efectos combinados na morfoxénese in vitro e na produción de metabolitos secundarios para proporcionar novos coñecementos para mellorar as características das plantas medicinais. Polo tanto, este estudo ten dous obxectivos: (1) optimizar a concentración de reguladores de crecemento vexetal para promover eficazmente a formación de callos, a rexeneración de brotes e o enraizamento in vitro; e (2) avaliar os efectos das nanopartículas de Fe₃O₄ nos parámetros de crecemento in vitro. Os plans futuros inclúen a avaliación da taxa de supervivencia das plantas rexeneradas durante a aclimatación (in vitro). Espérase que os resultados deste estudo melloren significativamente a eficiencia da micropropagación de *H. perforatum*, contribuíndo así ao uso sostible e ás aplicacións biotecnolóxicas desta importante planta medicinal.
Neste estudo, obtivemos explantes de follas de plantas anuais de herba de San Xoán cultivadas no campo (plantas nai). Estes explantes empregáronse para optimizar as condicións de cultivo in vitro. Antes do cultivo, as follas enxágáronse completamente con auga destilada corrente durante varios minutos. As superficies dos explantes desinfectáronse despois mediante inmersión en etanol ao 70 % durante 30 segundos, seguida de inmersión nunha solución de hipoclorito de sodio (NaOCl) ao 1,5 % que contiña unhas gotas de Tween 20 durante 10 minutos. Finalmente, os explantes enxágáronse tres veces con auga destilada estéril antes de transferilos ao seguinte medio de cultivo.
Durante as seguintes catro semanas, medíronse os parámetros de rexeneración dos gromos, incluíndo a taxa de rexeneración, o número de gromos por explante e a lonxitude dos gromos. Cando os gromos rexenerados alcanzaron unha lonxitude de polo menos 2 cm, transferíronse a un medio de enraizamento que consistía en medio MS á metade da concentración, 0,5 mg/L de ácido indolebutírico (IBA) e goma guar ao 0,3 %. O cultivo de enraizamento continuou durante tres semanas, durante as cales se mediron a taxa de enraizamento, o número de raíces e a lonxitude das raíces. Cada tratamento repetiuse tres veces, con 10 explantes cultivados por réplica, o que produciu aproximadamente 30 explantes por tratamento.
A altura da planta mediuse en centímetros (cm) cunha regra, desde a base da planta ata a punta da folla máis alta. A lonxitude da raíz mediuse en milímetros (mm) inmediatamente despois de retirar coidadosamente as plántulas e retirar o medio de cultivo. O número de xemas por explante contouse directamente en cada planta. O número de manchas negras nas follas, coñecidas como nódulos, mediuse visualmente. Crese que estes nódulos negros son glándulas que conteñen hipericina, ou manchas oxidativas, e utilízanse como indicador fisiolóxico da resposta da planta ao tratamento. Despois de retirar todo o medio de cultivo, mediuse o peso fresco das plántulas cunha báscula electrónica cunha precisión de miligramos (mg).
O método para calcular a taxa de formación de calos é o seguinte: despois de cultivar explantes nun medio que contén varios reguladores de crecemento (quinases, 2,4-D e Fe3O4) durante catro semanas, cóntase o número de explantes capaces de formar calos. A fórmula para calcular a taxa de formación de calos é a seguinte:
Cada tratamento repetiuse tres veces, examinando polo menos 10 explantes en cada repetición.
A taxa de rexeneración reflicte a proporción de tecido caloso que completa con éxito o proceso de diferenciación das xemas despois da etapa de formación do calo. Este indicador demostra a capacidade do tecido caloso para transformarse en tecido diferenciado e medrar en novos órganos da planta.
O coeficiente de enraizamento é a relación entre o número de ramas capaces de enraizar e o número total de ramas. Este indicador reflicte o éxito da fase de enraizamento, que é crucial na micropropagación e na propagación das plantas, xa que un bo enraizamento axuda ás mudas a sobrevivir mellor en condicións de crecemento.
Os compostos de hipericina extraéronse con metanol ao 90 %. Engadíronse cincuenta mg de material vexetal seco a 1 ml de metanol e sonicouse durante 20 minutos a 30 kHz nun limpador ultrasónico (modelo A5120-3YJ) a temperatura ambiente na escuridade. Despois da sonicación, a mostra centrifugouse a 6000 rpm durante 15 minutos. Recolleuse o sobrenadante e mediuse a absorbancia da hipericina a 592 nm cun espectrofotómetro Plus-3000 S segundo o método descrito por Conceiçao et al. [14].
A maioría dos tratamentos con reguladores do crecemento vexetal (RCP) e nanopartículas de óxido de ferro (Fe₃O₄-NP) non induciron a formación de nódulos negros nas follas rexeneradas dos brotes. Non se observaron nódulos en ningún dos tratamentos con 0,5 ou 1 mg/L de 2,4-D, 0,5 ou 1 mg/L de cinetina ou 1, 2 ou 4 mg/L de nanopartículas de óxido de ferro. Algunhas combinacións mostraron un lixeiro aumento no desenvolvemento de nódulos (pero non estatisticamente significativo) a concentracións máis altas de cinetina e/ou nanopartículas de óxido de ferro, como a combinación de 2,4-D (0,5–2 mg/L) con cinetina (1–1,5 mg/L) e nanopartículas de óxido de ferro (2–4 mg/L). Estes resultados móstranse na Figura 2. Os nódulos negros representan glándulas ricas en hipericina, tanto de orixe natural como beneficiosas. Neste estudo, os nódulos negros asociáronse principalmente co escurecemento dos tecidos, o que indica un ambiente favorable para a acumulación de hipericina. O tratamento con nanopartículas de 2,4-D, cinetina e Fe₃O₄ promoveu o crecemento do calo, reduciu o escurecemento e aumentou o contido de clorofila, o que suxire unha mellor función metabólica e unha posible redución do dano oxidativo [37]. Este estudo avaliou os efectos da cinetina en combinación con nanopartículas de 2,4-D e Fe₃O₄ no crecemento e desenvolvemento do calo de herba de San Xoán (Fig. 3a–g). Estudos previos demostraron que as nanopartículas de Fe₃O₄ teñen actividades antifúnxicas e antimicrobianas [38, 39] e, cando se usan en combinación con reguladores do crecemento das plantas, poden estimular os mecanismos de defensa das plantas e reducir os índices de estrés celular [18]. Aínda que a biosíntese de metabolitos secundarios está regulada xeneticamente, o seu rendemento real depende en gran medida das condicións ambientais. Os cambios metabólicos e morfolóxicos poden influír nos niveis de metabolitos secundarios ao regular a expresión de xenes vexetais específicos e responder a factores ambientais. Ademais, os indutores poden desencadear a activación de novos xenes, que á súa vez estimulan a actividade encimática, activando en última instancia múltiples vías biosintéticas e levando á formación de metabolitos secundarios. Por outra banda, outro estudo demostrou que a redución da sombra aumenta a exposición á luz solar, elevando así as temperaturas diúrnas no hábitat natural de *Hypericum perforatum*, o que tamén contribúe a un maior rendemento de hipericina. Baseándose nestes datos, este estudo investigou o papel das nanopartículas de ferro como posibles indutores no cultivo de tecidos. Os resultados mostraron que estas nanopartículas poden activar xenes implicados na biosíntese de hesperidina mediante a estimulación encimática, o que leva a unha maior acumulación deste composto (Fig. 2). Polo tanto, en comparación coas plantas que crecen en condicións naturais, pódese argumentar que a produción de tales compostos in vivo tamén se pode mellorar cando se combina un estrés moderado coa activación de xenes implicados na biosíntese de metabolitos secundarios. Os tratamentos combinados xeralmente teñen un efecto positivo na taxa de rexeneración, pero nalgúns casos, este efecto vese debilitado. Cabe destacar que o tratamento con 1 mg/L de 2,4-D, 1,5 mg/L de quinase e diferentes concentracións puido aumentar de forma independente e significativa a taxa de rexeneración nun 50,85 % en comparación co grupo de control (Fig. 4c). Estes resultados suxiren que combinacións específicas de nanohormonas poden actuar de forma sinerxética para promover o crecemento das plantas e a produción de metabolitos, o que é de gran importancia para o cultivo de tecidos de plantas medicinais. Palmer e Keller [50] demostraron que o tratamento con 2,4-D podía inducir de forma independente a formación de calos en St. perforatum, mentres que a adición de quinase mellorou significativamente a formación e rexeneración de calos. Este efecto debeuse á mellora do equilibrio hormonal e á estimulación da división celular. Bal et al. [51] descubriron que o tratamento con Fe₃O₄-NP podía mellorar de forma independente a función dos encimas antioxidantes, promovendo así o crecemento das raíces en St. perforatum. Os medios de cultivo que contiñan nanopartículas de Fe₃O₄ a concentracións de 0,5 mg/L, 1 mg/L e 1,5 mg/L melloraron a taxa de rexeneración das plantas de liño [52]. O uso de cinetina, 2,4-diclorobenzotiazolinona e nanopartículas de Fe₃O₄ mellorou significativamente as taxas de formación de calos e raíces; porén, débense ter en conta os posibles efectos secundarios do uso destas hormonas para a rexeneración in vitro. Por exemplo, o uso a longo prazo ou en alta concentración de 2,4-diclorobenzotiazolinona ou cinetina pode provocar variación clonal somática, estrés oxidativo, morfoloxía anormal do calo ou vitrificación. Polo tanto, unha alta taxa de rexeneración non predí necesariamente a estabilidade xenética. Todas as plantas rexeneradas deben avaliarse mediante marcadores moleculares (por exemplo, RAPD, ISSR, AFLP) ou análise citoxenética para determinar a súa homoxeneidade e semellanza coas plantas in vivo [53,54,55].
Este estudo demostrou por primeira vez que o uso combinado de reguladores do crecemento vexetal (2,4-D e cinetina) con nanopartículas de Fe₃O₄ pode mellorar a morfoxénese e a acumulación de metabolitos bioactivos clave (incluíndo hipericina e hiperósido) en *Hypericum perforatum*. O réxime de tratamento optimizado (1 mg/L de 2,4-D + 1 mg/L de cinetina + 4 mg/L de Fe₃O₄-NPs) non só maximizou a formación de calos, a organoxénese e o rendemento de metabolitos secundarios, senón que tamén demostrou un efecto indutor leve, mellorando potencialmente a tolerancia ao estrés e o valor medicinal da planta. A combinación de nanotecnoloxía e cultivo de tecidos vexetais proporciona unha plataforma sostible e eficiente para a produción in vitro a grande escala de compostos medicinais. Estes resultados allanan o camiño para aplicacións industriais e futuras investigacións sobre mecanismos moleculares, optimización de dosificación e precisión xenética, vinculando así a investigación fundamental sobre plantas medicinais coa biotecnoloxía práctica.
Data de publicación: 12 de decembro de 2025