O crecemento do meristema apical do brote (SAM) é fundamental para a arquitectura do talo. Hormonas vexetaisxiberelinasOs GA (agentes gástricos) desempeñan papeis clave na coordinación do crecemento das plantas, pero o seu papel no SAM segue a ser pouco coñecido. Aquí, desenvolvemos un biosensor ratiométrico de sinalización GA mediante a enxeñaría da proteína DELLA para suprimir a súa función reguladora esencial na resposta transcricional de GA, preservando ao mesmo tempo a súa degradación tras o recoñecemento de GA. Demostramos que este biosensor baseado na degradación rexistra con precisión os cambios nos niveis de GA e na detección celular durante o desenvolvemento. Usamos este biosensor para mapear a actividade de sinalización GA no SAM. Demostramos que os sinais GA altos están presentes predominantemente en células situadas entre os primordios dos órganos, que son precursores das células internodales. Usando enfoques de ganancia e perda de función, demostramos ademais que o GA regula a orientación do plano de división celular, establecendo a organización celular canónica dos internodales, promovendo así a especificación internodal no SAM.
O meristemo apical do gromo (MAD), situado no ápice do gromo, contén un nicho de células nai cuxa actividade xera órganos laterais e nodos do talo de maneira modular e iterativa ao longo da vida da planta. Cada unha destas unidades repetitivas, ou nodos da planta, inclúe internodos e órganos laterais nos nodos, e meristemos axilares nas axilas das follas1. O crecemento e a organización dos nodos da planta cambian durante o desenvolvemento. En Arabidopsis, o crecemento internodal suprímese durante a fase vexetativa e os meristemos axilares permanecen latentes nas axilas das follas da roseta. Durante a transición á fase floral, o MAD convértese no meristemo da inflorescencia, xerando internodos alongados e xemas axilares, ramilletes nas axilas das follas caulinares e, máis tarde, flores sen follas2. Aínda que fixemos progresos significativos na comprensión dos mecanismos que controlan o inicio das follas, flores e ramas, sábese relativamente pouco sobre como xorden os internodos.
Comprender a distribución espaciotemporal dos GA axudará a comprender mellor as funcións destas hormonas en diferentes tecidos e en diferentes etapas de desenvolvemento. A visualización da degradación da fusión RGA-GFP expresada baixo a acción do seu propio promotor proporciona información importante sobre a regulación dos niveis totais de GA nas raíces15,16. Non obstante, a expresión de RGA varía entre os tecidos17 e está regulada por GA18. Polo tanto, a expresión diferencial do promotor RGA pode dar lugar ao patrón de fluorescencia observado con RGA-GFP e, polo tanto, este método non é cuantitativo. Máis recentemente, o GA19,20 marcado con fluoresceína bioactiva (Fl) revelou a acumulación de GA no endocórtex da raíz e a regulación dos seus niveis celulares mediante o transporte de GA. Recentemente, o sensor GA FRET nlsGPS1 mostrou que os niveis de GA se correlacionan co alongamento celular en raíces, filamentos e hipocótilos de crecemento escuro21. Non obstante, como vimos, a concentración de GA non é o único parámetro que controla a actividade de sinalización de GA, xa que depende de procesos de detección complexos. Aquí, baseándonos no noso coñecemento das vías de sinalización DELLA e GA, informamos do desenvolvemento e caracterización dun biosensor ratiométrico baseado na degradación para a sinalización GA. Para desenvolver este biosensor cuantitativo, empregamos un RGA mutante sensible a GA que se fusionou a unha proteína fluorescente e se expresou ubicuamente nos tecidos, así como unha proteína fluorescente insensible a GA. Demostramos que as fusións de proteínas RGA mutantes non interfiren coa sinalización GA endóxena cando se expresan ubicuamente, e que este biosensor pode cuantificar a actividade de sinalización resultante tanto da entrada de GA como do procesamento do sinal GA polo aparato sensor con alta resolución espaciotemporal. Empregamos este biosensor para mapear a distribución espaciotemporal da actividade de sinalización GA e cuantificar como o GA regula o comportamento celular na epiderme SAM. Demostramos que o GA regula a orientación do plano de división das células SAM situadas entre os primordios dos órganos, definindo así a organización celular canónica do internodo.
Finalmente, preguntámonos se qmRGA podería informar de cambios nos niveis endóxenos de GA usando hipocótilos en crecemento. Anteriormente demostramos que o nitrato estimula o crecemento ao aumentar a síntese de GA e, á súa vez, a degradación de DELLA34. En consecuencia, observamos que a lonxitude do hipocótilo nas plántulas pUBQ10::qmRGA cultivadas baixo un fornecemento abundante de nitrato (10 mM NO3−) era significativamente maior que a das plántulas cultivadas en condicións deficientes en nitratos (Fig. suplementaria 6a). En consonancia coa resposta de crecemento, os sinais de GA foron máis altos nos hipocótilos das plántulas cultivadas en condicións de 10 mM NO3− que nas plántulas cultivadas en ausencia de nitrato (Fig. suplementaria 6b, c). Polo tanto, qmRGA tamén permite monitorizar os cambios na sinalización de GA inducidos por cambios endóxenos na concentración de GA.
Para comprender se a actividade de sinalización de GA detectada por qmRGA depende da concentración de GA e da percepción de GA, como se esperaba en función do deseño do sensor, analizamos a expresión dos tres receptores GID1 en tecidos vexetativos e reprodutivos. Nas plántulas, a liña indicadora GID1-GUS mostrou que GID1a e c estaban altamente expresados en cotiledóns (Fig. 3a-c). Ademais, os tres receptores expresáronse en follas, primordios das raíces laterais, puntas das raíces (excepto a cofia da raíz de GID1b) e o sistema vascular (Fig. 3a-c). Na SAM da inflorescencia, detectamos sinais GUS só para GID1b e 1c (Fig. suplementaria 7a-c). A hibridación in situ confirmou estes patróns de expresión e demostrou ademais que GID1c se expresaba uniformemente a niveis baixos na SAM, mentres que GID1b mostraba unha maior expresión na periferia da SAM (Fig. suplementaria 7d-l). A fusión translacional pGID1b::2xmTQ2-GID1b tamén revelou un rango gradual de expresión de GID1b, desde baixa ou nula expresión no centro da SAM ata alta expresión nos bordos dos órganos (Fig. suplementaria 7m). Polo tanto, os receptores GID1 non se distribúen uniformemente entre os tecidos e dentro deles. En experimentos posteriores, tamén observamos que a sobreexpresión de GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) aumentou a sensibilidade de qmRGA nos hipocótilos á aplicación externa de GA (Fig. 3d, e). En contraste, a fluorescencia medida por qd17mRGA no hipocótilo foi insensible ao tratamento con GA3 (Fig. 3f, g). Para ambos os ensaios, as mudas tratáronse con altas concentracións de GA (100 μM de GA3) para avaliar o comportamento rápido do sensor, onde a capacidade de unirse ao receptor GID1 se mellorou ou se perdeu. Conxuntamente, estes resultados confirman que o biosensor qmRGA cumpre unha función combinada como sensor de GA e GA, e suxiren que a expresión diferencial do receptor GID1 pode modular significativamente a emisividade do sensor.
Ata a data, a distribución dos sinais de GA no SAM segue sen estar clara. Polo tanto, empregamos plantas que expresan qmRGA e o reporteiro de células nai pCLV3::mCherry-NLS35 para calcular mapas cuantitativos de alta resolución da actividade de sinalización de GA, centrándonos na capa L1 (epiderme; Fig. 4a, b, ver Métodos e Métodos Suplementarios), xa que L1 xoga un papel clave no control do crecemento da SAM36. Aquí, a expresión de pCLV3::mCherry-NLS proporcionou un punto de referencia xeométrico fixo para analizar a distribución espaciotemporal da actividade de sinalización de GA37. Aínda que o GA se considera esencial para o desenvolvemento lateral dos órganos4, observamos que os sinais de GA eran baixos no primordio floral (P) a partir da etapa P3 (Fig. 4a, b), mentres que os primordios P1 e P2 novos tiñan unha actividade moderada similar á da rexión central (Fig. 4a, b). Detectouse unha maior actividade de sinalización GA nos límites dos primordios dos órganos, comezando en P1/P2 (nos lados do límite) e alcanzando o seu máximo en P4, así como en todas as células da rexión periférica situada entre os primordios (Fig. 4a, b e Fig. suplementaria 8a, b). Esta maior actividade de sinalización GA observouse non só na epiderme, senón tamén nas capas L2 e L3 superior (Fig. suplementaria 8b). O patrón de sinais GA detectados no SAM usando qmRGA tamén permaneceu sen cambios ao longo do tempo (Fig. suplementaria 8c-f, k). Aínda que a construción qd17mRGA foi sistematicamente regulada á baixa no SAM de plantas T3 de cinco liñas independentes que caracterizamos en detalle, puidemos analizar os patróns de fluorescencia obtidos coa construción pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Fig. suplementaria 8g-j, l). Nesta liña de control, só se detectaron cambios menores na proporción de fluorescencia no SAM, pero no centro do SAM observamos unha diminución clara e inesperada en VENUS asociada con TagBFP. Isto confirma que o patrón de sinalización observado por qmRGA reflicte a degradación dependente de GA de mRGA-VENUS, pero tamén demostra que qmRGA pode sobreestimar a actividade de sinalización GA no centro do meristema. En resumo, os nosos resultados revelan un patrón de sinalización GA que reflicte principalmente a distribución dos primordios. Esta distribución da rexión interprimordial (IPR) débese ao establecemento gradual dunha alta actividade de sinalización GA entre o primordio en desenvolvemento e a rexión central, mentres que ao mesmo tempo a actividade de sinalización GA no primordio diminúe (Fig. 4c, d).
A distribución dos receptores GID1b e GID1c (véxase arriba) suxire que a expresión diferencial dos receptores GA axuda a configurar o patrón de actividade de sinalización GA no SAM. Preguntámonos se a acumulación diferencial de GA podería estar implicada. Para investigar esta posibilidade, empregamos o sensor nlsGPS1 GA FRET21. Detectouse un aumento na frecuencia de activación no SAM de nlsGPS1 tratado con 10 μM de GA4+7 durante 100 min (Fig. suplementaria 9a-e), o que indica que nlsGPS1 responde aos cambios na concentración de GA no SAM, como fai nas raíces21. A distribución espacial da frecuencia de activación de nlsGPS1 revelou niveis de GA relativamente baixos nas capas externas do SAM, pero mostrou que estaban elevados no centro e nos bordos do SAM (Fig. 4e e Fig. suplementaria 9a,c). Isto suxire que o GA tamén se distribúe no SAM cun patrón espacial comparable ao revelado por qmRGA. Como enfoque complementario, tamén tratamos o SAM con GA fluorescente (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ou Fl só como control negativo. O sinal de Fl distribuíuse por todo o SAM, incluíndo a rexión central e o primordio, aínda que a unha intensidade menor (Fig. 4j e Fig. suplementaria 10d). En contraste, os tres GA-Fl acumuláronse especificamente dentro dos límites do primordio e en graos variables no resto do IPR, con GA7-Fl acumulándose no dominio máis grande do IPR (Fig. 4k e Fig. suplementarias 10a,b). A cuantificación da intensidade de fluorescencia revelou que a relación de intensidade de IPR a non IPR era maior no SAM tratado con GA-Fl en comparación co SAM tratado con Fl (Fig. 4l e Fig. suplementaria 10c). Conxuntamente, estes resultados suxiren que o GA está presente en concentracións máis altas nas células IPR que se atopan máis preto do límite do órgano. Isto suxire que o patrón de actividade de sinalización GA da SAM é o resultado tanto da expresión diferencial dos receptores GA como da acumulación diferencial de GA nas células IPR preto dos límites dos órganos. Polo tanto, a nosa análise revelou un patrón espazotemporal inesperado de sinalización GA, con menor actividade no centro e primordio da SAM e maior actividade no IPR na rexión periférica.
Para comprender o papel da actividade diferencial de sinalización GA no SAM, analizamos a correlación entre a actividade de sinalización GA, a expansión celular e a división celular utilizando imaxes en tempo real do qmRGA pCLV3::mCherry-NLS do SAM. Dado o papel do GA na regulación do crecemento, esperábase unha correlación positiva cos parámetros de expansión celular. Polo tanto, primeiro comparamos os mapas de actividade de sinalización GA cos mapas da taxa de crecemento da superficie celular (como indicador da forza da expansión celular para unha célula dada e para as células fillas na división) e cos mapas de anisotropía do crecemento, que miden a direccionalidade da expansión celular (tamén usado aquí para unha célula dada e para as células fillas na división; Fig. 5a,b, ver Métodos e Métodos Suplementarios). Os nosos mapas da taxa de crecemento da superficie celular do SAM son consistentes con observacións previas38,39, con taxas de crecemento mínimas no bordo e taxas de crecemento máximas nas flores en desenvolvemento (Fig. 5a). A análise de compoñentes principais (PCA) mostrou que a actividade de sinalización GA estaba correlacionada negativamente coa intensidade do crecemento da superficie celular (Figura 5c). Tamén demostramos que os principais eixes de variación, incluíndo a entrada de sinalización GA e a intensidade de crecemento, eran ortogonais á dirección determinada pola alta expresión de CLV3, o que confirma a exclusión de células do centro SAM nas análises restantes. A análise de correlación de Spearman confirmou os resultados da PCA (Figura 5d), o que indica que uns sinais GA máis altos no IPR non resultaron nunha maior expansión celular. Non obstante, a análise de correlación revelou unha lixeira correlación positiva entre a actividade de sinalización GA e a anisotropía de crecemento (Figura 5c, d), o que suxire que unha maior sinalización GA no IPR inflúe na dirección do crecemento celular e posiblemente na posición do plano de división celular.
a, b Mapas de calor do crecemento superficial medio (a) e da anisotropía do crecemento (b) en SAM calculados como media en sete plantas independentes (usadas como indicadores da forza e a dirección da expansión celular, respectivamente). c A análise PCA incluíu as seguintes variables: sinal GA, intensidade do crecemento superficial, anisotropía do crecemento superficial e expresión de CLV3. O compoñente 1 do PCA estaba principalmente correlacionado negativamente coa intensidade do crecemento superficial e positivamente co sinal GA. O compoñente 2 do PCA estaba principalmente correlacionado positivamente coa anisotropía do crecemento superficial e negativamente correlacionado coa expresión de CLV3. As porcentaxes representan a variación explicada por cada compoñente. d Análise de correlación de Spearman entre o sinal GA, a intensidade do crecemento superficial e a anisotropía do crecemento superficial a escala de tecido, excluíndo CZ. O número da dereita é o valor rho de Spearman entre dúas variables. Os asteriscos indican casos nos que a correlación/correlación negativa é moi significativa. e Visualización 3D das células Col-0 SAM L1 mediante microscopía confocal. As novas paredes celulares formadas no SAM (pero non no primordio) ás 10 h están coloreadas segundo os seus valores angulares. A barra de cores móstrase na esquina inferior dereita. O recadro mostra a imaxe 3D correspondente ás 0 h. O experimento repetiuse dúas veces con resultados similares. f Os diagramas de caixa mostran as taxas de división celular en SAM Col-0 IPR e sen IPR (n = 10 plantas independentes). A liña central mostra a mediana e os límites da caixa indican os percentiles 25 e 75. Os bigotes indican os valores mínimos e máximos determinados co software R. Os valores de P obtivéronse coa proba t bilateral de Welch. g, h Diagrama esquemático que mostra (g) como medir o ángulo da nova parede celular (maxenta) con respecto á dirección radial desde o centro do SAM (liña punteada branca) (só se consideran os valores de ángulo agudo, é dicir, 0–90°), e (h) as direccións circunferenciais/laterais e radiais dentro do meristema. i Histogramas de frecuencia da orientación do plano de división celular a través do SAM (azul escuro), IPR (azul medio) e sen IPR (azul claro), respectivamente. Os valores de p obtivéronse mediante unha proba de Kolmogorov-Smirnov bicauda. O experimento repetiuse dúas veces con resultados similares. j Histogramas de frecuencia da orientación do plano de división celular da IPR arredor de P3 (verde claro), P4 (verde medio) e P5 (verde escuro), respectivamente. Os valores de p obtivéronse mediante unha proba de Kolmogorov-Smirnov bicauda. O experimento repetiuse dúas veces con resultados similares.
Polo tanto, investigamos a continuación a correlación entre a sinalización GA e a actividade de división celular identificando paredes celulares recentemente formadas durante o ensaio (Fig. 5e). Esta abordaxe permitiunos medir a frecuencia e a dirección da división celular. Sorprendentemente, descubrimos que a frecuencia das divisións celulares no IPR e no resto do SAM (non IPR, Fig. 5f) era similar, o que indica que as diferenzas na sinalización GA entre as células IPR e as non IPR non afectan significativamente a división celular. Isto, e a correlación positiva entre a sinalización GA e a anisotropía do crecemento, levounos a considerar se a actividade de sinalización GA podería influír na orientación do plano de división celular. Medimos a orientación da nova parede celular como un ángulo agudo en relación co eixe radial que conecta o centro do meristema e o centro da nova parede celular (Fig. 5e-i) e observamos unha clara tendencia das células a dividirse en ángulos próximos aos 90° en relación co eixe radial, coas frecuencias máis altas observadas en 70–80° (23,28 %) e 80–90° (22,62 %) (Fig. 5e,i), correspondentes a divisións celulares na dirección circunferencial/transversa (Fig. 5h). Para examinar a contribución da sinalización GA a este comportamento de división celular, analizamos os parámetros de división celular na IPR e non-IPR por separado (Fig. 5i). Observamos que a distribución do ángulo de división nas células IPR difería da das células non IPR ou das células de toda a SAM, presentando as células IPR unha maior proporción de divisións celulares laterais/circulares, é dicir, 70–80° e 80–90° (33,86 % e 30,71 %, respectivamente, proporcións correspondentes) (Fig. 5i). Polo tanto, as nosas observacións revelaron unha asociación entre unha alta sinalización GA e unha orientación do plano de división celular próxima á dirección circunferencial, similar á correlación entre a actividade de sinalización GA e a anisotropía do crecemento (Fig. 5c, d). Para establecer aínda máis a conservación espacial desta asociación, medimos a orientación do plano de división nas células IPR que rodean o primordio a partir de P3, xa que a maior actividade de sinalización GA detectouse nesta rexión a partir de P4 (Fig. 4). Os ángulos de división da IPR arredor de P3 e P4 non mostraron diferenzas estatisticamente significativas, aínda que se observou unha maior frecuencia de divisións celulares laterais na IPR arredor de P4 (Fig. 5j). Non obstante, nas células IPR arredor de P5, a diferenza na orientación do plano de división celular volveuse estatisticamente significativa, cun forte aumento na frecuencia das divisións celulares transversais (Fig. 5j). Conxuntamente, estes resultados suxiren que a sinalización GA pode controlar a orientación das divisións celulares no SAM, o que é consistente con informes previos40,41 de que unha alta sinalización GA pode inducir a orientación lateral das divisións celulares no IPR.
Prevese que as células da IPR non se incorporarán aos primordios, senón aos internodos2,42,43. A orientación transversal das divisións celulares na IPR pode dar lugar á organización típica de filas lonxitudinais paralelas de células epidérmicas nos internodos. As nosas observacións descritas anteriormente suxiren que a sinalización GA probablemente desempeña un papel neste proceso ao regular a dirección da división celular.
A perda de función de varios xenes DELLA resulta nunha resposta GA constitutiva, e os mutantes della pódense usar para probar esta hipótese44. Primeiro analizamos os patróns de expresión de cinco xenes DELLA no SAM. A fusión transcricional da liña GUS45 revelou que GAI, RGA, RGL1 e RGL2 (en moita menor medida) expresábanse no SAM (Fig. suplementaria 11a-d). A hibridación in situ demostrou ademais que o ARNm de GAI se acumula especificamente nos primordios e nas flores en desenvolvemento (Fig. suplementaria 11e). Detectáronse ARNm de RGL1 e RGL3 en toda a copa do SAM e nas flores máis vellas, mentres que o ARNm de RGL2 era máis abundante na rexión fronteiriza (Fig. suplementaria 11f-h). A imaxe confocal do SAM pRGL3::RGL3-GFP confirmou a expresión observada por hibridación in situ e mostrou que a proteína RGL3 se acumula na parte central do SAM (Fig. suplementaria 11i). Usando a liña pRGA::GFP-RGA, tamén descubrimos que a proteína RGA se acumula no SAM, pero a súa abundancia diminúe no límite a partir de P4 (Fig. suplementaria 11j). Cabe destacar que os patróns de expresión de RGL3 e RGA son consistentes cunha maior actividade de sinalización GA no IPR, detectada por qmRGA (Fig. 4). Ademais, estes datos indican que todos os DELLA se expresan no SAM e que a súa expresión abrangue colectivamente todo o SAM.
A continuación, analizamos os parámetros de división celular no SAM de tipo salvaxe (Ler, control) e nos mutantes gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quíntuple (global) (Fig. 6a, b). Curiosamente, observamos un cambio estatisticamente significativo na distribución das frecuencias dos ángulos de división celular no SAM mutante della global en comparación co tipo salvaxe (Fig. 6c). Este cambio no mutante della global debeuse a un aumento na frecuencia dos ángulos de 80–90° (34,71% fronte a 24,55%) e, en menor medida, dos ángulos de 70–80° (23,78% fronte a 20,18%), é dicir, correspondentes a divisións celulares transversais (Fig. 6c). A frecuencia das divisións non transversais (0–60°) tamén foi menor no mutante della global (Fig. 6c). A frecuencia das divisións celulares transversais aumentou significativamente no SAM do mutante della global (Fig. 6b). A frecuencia de divisións celulares transversais na IPR tamén foi maior no mutante della global en comparación co tipo salvaxe (Fig. 6d). Fóra da rexión IPR, o tipo salvaxe tiña unha distribución máis uniforme dos ángulos de división celular, mentres que o mutante della global prefería as divisións tanxenciais como a IPR (Fig. 6e). Tamén cuantificamos a orientación das divisións celulares no SAM dos mutantes quíntuplos da ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 e ga2ox6-2), un fondo mutante inactivo para GA no que se acumula GA. En consonancia co aumento dos niveis de GA, a SAM da inflorescencia mutante quíntuplo ga2ox foi maior que a de Col-0 (Fig. suplementaria 12a, b) e, en comparación con Col-0, a SAM quíntuplo ga2ox mostrou unha distribución claramente diferente dos ángulos de división celular, coa frecuencia angular aumentando de 50° a 90°, é dicir, favorecendo de novo as divisións tanxenciais (Fig. suplementaria 12a-c). Polo tanto, demostramos que a activación constitutiva da sinalización de GA e a acumulación de GA inducen divisións celulares laterais na IPR e no resto da SAM.
a, b Visualización 3D da capa L1 de SAM tinguida con PI de Ler (a) e mutante della global (b) mediante microscopía confocal. As novas paredes celulares formadas no SAM (pero non no primordio) durante un período de 10 h móstranse e coloreanse segundo os seus valores angulares. O recadro mostra o SAM ás 0 h. A barra de cores móstrase na esquina inferior dereita. A frecha en (b) apunta a un exemplo de ficheiros celulares aliñados no mutante della global. O experimento repetiuse dúas veces con resultados similares. comparación da distribución de frecuencias das orientacións do plano de división celular no SAM completo (d), IPR (e) e non IPR (f) entre Ler e della global. Os valores de P obtivéronse mediante unha proba de Kolmogorov-Smirnov bicauda. f, g Visualización 3D de imaxes confocais de SAM tinguida con PI de plantas transxénicas Col-0 (i) e pCUC2::gai-1-VENUS (j). Os paneis (a, b) mostran novas paredes celulares (pero non primordios) formadas no SAM en 10 h. O experimento repetiuse dúas veces con resultados similares. h–j Comparación da distribución de frecuencias das orientacións do plano de división celular localizadas en todo o SAM (h), IPR (i) e non IPR (j) entre as plantas Col-0 e pCUC2::gai-1-VENUS. Os valores de P obtivéronse mediante unha proba de Kolmogorov-Smirnov bilateral.
A continuación, probamos o efecto da inhibición da sinalización GA especificamente na IPR. Para este fin, empregamos o promotor da copa de cotiledón 2 (CUC2) para impulsar a expresión dunha proteína gai-1 dominante negativa fusionada a VENUS (na liña pCUC2::gai-1-VENUS). No SAM de tipo salvaxe, o promotor CUC2 impulsa a expresión da maioría das IPR no SAM, incluídas as células limítrofes, desde P4 en diante, e observouse unha expresión específica similar nas plantas pCUC2::gai-1-VENUS (véxase máis abaixo). A distribución dos ángulos de división celular a través do SAM ou IPR das plantas pCUC2::gai-1-VENUS non foi significativamente diferente da do tipo salvaxe, aínda que inesperadamente descubrimos que as células sen IPR nestas plantas dividíanse a unha frecuencia máis alta de 80–90° (Fig. 6f–j).
Suxeriuse que a dirección da división celular depende da xeometría do SAM, en particular da tensión de tracción xerada pola curvatura do tecido46. Polo tanto, preguntámonos se a forma do SAM estaba alterada no mutante della global e nas plantas pCUC2::gai-1-VENUS. Como se informou anteriormente12, o tamaño do SAM mutante della global era maior que o do tipo salvaxe (Fig. suplementaria 13a, b, d). A hibridación in situ de CLV3 e ARN STM confirmou a expansión do meristema nos mutantes della e mostrou ademais a expansión lateral do nicho de células nai (Fig. suplementaria 13e, f, h, i). Non obstante, a curvatura do SAM foi similar en ambos os xenotipos (Fig. suplementaria 13k, m, n, p). Observamos un aumento similar de tamaño no mutante cuádruplo della gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 sen un cambio na curvatura en comparación co tipo salvaxe (Fig. suplementaria 13c, d, g, j, l, o, p). A frecuencia da orientación da división celular tamén se viu afectada no mutante cuádruplo della, pero en menor medida que no mutante monolítico della (Fig. suplementaria 12d-f). Este efecto de dosificación, xunto coa falta dun efecto sobre a curvatura, suxire que a actividade residual de RGL3 no mutante cuádruplo Della limita os cambios na orientación da división celular causados pola perda da actividade de DELLA e que os cambios nas divisións celulares laterais ocorren en resposta a cambios na actividade de sinalización GA en lugar de cambios na xeometría do SAM. Como se describiu anteriormente, o promotor CUC2 impulsa a expresión de IPR no SAM a partir de P4 (Fig. suplementaria 14a, b) e, en contraste, o SAM pCUC2::gai-1-VENUS tiña un tamaño reducido pero unha maior curvatura (Fig. suplementaria 14c-h). Este cambio na morfoloxía do SAM pCUC2::gai-1-VENUS pode resultar nunha distribución diferente das tensións mecánicas en comparación co tipo salvaxe, no que as tensións circunferenciais elevadas comezan a unha distancia máis curta do centro do SAM47. Alternativamente, os cambios na morfoloxía de pCUC2::gai-1-VENUS SAM poden ser o resultado de cambios nas propiedades mecánicas rexionais inducidas pola expresión transxénica48. En ambos os casos, isto podería compensar parcialmente os efectos dos cambios na sinalización GA ao aumentar a probabilidade de que as células se dividan na orientación circunferencial/transversa, o que explica as nosas observacións.
En conxunto, os nosos datos confirman que unha maior sinalización GA xoga un papel activo na orientación lateral do plano de división celular na IPR. Tamén mostran que a curvatura do meristema tamén inflúe na orientación do plano de división celular na IPR.
A orientación transversal do plano de división no IPR, debido á alta actividade de sinalización GA, suxire que o GA preorganiza un ficheiro celular radial na epiderme dentro do SAM para definir a organización celular que posteriormente se atopará no internodo epidérmico. De feito, estes ficheiros celulares eran frecuentemente visibles nas imaxes SAM de mutantes della globais (Fig. 6b). Polo tanto, para explorar máis a fondo a función de desenvolvemento do patrón espacial da sinalización GA no SAM, empregamos imaxes en lapso de tempo para analizar a organización espacial das células no IPR en plantas de tipo salvaxe (Ler e Col-0), mutantes della globais e plantas transxénicas pCUC2::gai-1-VENUS.
Descubrimos que qmRGA mostrou que a actividade de sinalización GA no IPR aumentou desde P1/P2 e alcanzou o seu máximo en P4, e este patrón mantívose constante ao longo do tempo (Fig. 4a-f e Fig. suplementaria 8c-f, k). Para analizar a organización espacial das células no IPR co aumento do sinal GA, etiquetamos as células Ler IPR por riba e aos lados de P4 segundo o seu destino de desenvolvemento analizado 34 h despois da primeira observación, é dicir, máis de dúas veces plastídicas, o que nos permitiu seguir as células IPR durante o desenvolvemento do primordio desde P1/P2 ata P4. Usamos tres cores diferentes: amarelo para as células que se integraron no primordio preto de P4, verde para as que estaban no IPR e púrpura para as que participaron en ambos procesos (Fig. 7a-c). En t0 (0 h), 1-2 capas de células IPR eran visibles diante de P4 (Fig. 7a). Como era de esperar, cando estas células se dividiron, fixérono principalmente a través do plano de división transversal (Figs. 7a-c). Obtivéronse resultados semellantes usando Col-0 SAM (centrándose en P3, cuxo bordo se prega de xeito similar a P4 en Ler), aínda que neste xenotipo o pregamento formado no bordo floral ocultou as células IPR máis rápido (Fig. 7g–i). Polo tanto, o patrón de división das células IPR preorganiza as células en filas radiais, como nos internodos. A organización das filas radiais e a localización das células IPR entre órganos sucesivos suxiren que estas células son proxenitores internodais.
Aquí, desenvolvemos un biosensor de sinalización GA ratiométrica, qmRGA, que permite o mapeo cuantitativo da actividade de sinalización GA resultante das concentracións combinadas de GA e receptor GA, minimizando a interferencia coas vías de sinalización endóxenas, proporcionando así información sobre a función GA a nivel celular. Con este fin, construímos unha proteína DELLA modificada, mRGA, que perdeu a capacidade de unirse aos socios de interacción DELLA pero segue sendo sensible á proteólise inducida por GA. qmRGA responde tanto a cambios exóxenos como endóxenos nos niveis de GA, e as súas propiedades de detección dinámica permiten a avaliación dos cambios espaciotemporais na actividade de sinalización GA durante o desenvolvemento. qmRGA tamén é unha ferramenta moi flexible, xa que se pode adaptar a diferentes tecidos cambiando o promotor utilizado para a súa expresión (se é necesario) e, dada a natureza conservada da vía de sinalización GA e o motivo PFYRE nas anxiospermas, é probable que sexa transferible a outras especies22. En consonancia con isto, tamén se demostrou que unha mutación equivalente na proteína DELLA do arroz SLR1 (HYY497AAA) suprime a actividade represora do crecemento de SLR1 mentres que só reduce lixeiramente a súa degradación mediada por GA, de xeito similar a mRGA23. Cabe destacar que estudos recentes en Arabidopsis mostraron que unha única mutación de aminoácido no dominio PFYRE (S474L) alterou a actividade transcricional de RGA sen afectar a súa capacidade para interactuar con socios de factores de transcrición50. Aínda que esta mutación é moi próxima ás 3 substitucións de aminoácidos presentes en mRGA, os nosos estudos mostran que estas dúas mutacións alteran características distintas de DELLA. Aínda que a maioría dos socios de factores de transcrición únense aos dominios LHR1 e SAW de DELLA26,51, algúns aminoácidos conservados no dominio PFYRE poden axudar a estabilizar estas interaccións.
O desenvolvemento do internodo é un trazo clave na arquitectura das plantas e na mellora do rendemento. qmRGA revelou unha maior actividade de sinalización GA nas células proxenitoras do internodo IPR. Ao combinar imaxes cuantitativas e xenética, demostramos que os patróns de sinalización GA superpoñen planos de división celular circulares/transversais na epiderme SAM, configurando a organización da división celular necesaria para o desenvolvemento do internodo. Identificáronse varios reguladores da orientación do plano de división celular durante o desenvolvemento52,53. O noso traballo proporciona un exemplo claro de como a actividade de sinalización GA regula este parámetro celular. DELLA pode interactuar con complexos proteicos de prepregamento41, polo que a sinalización GA pode regular a orientación do plano de división celular ao influír directamente na orientación dos microtúbulos corticais40,41,54,55. Demostramos inesperadamente que no SAM, o correlato dunha maior actividade de sinalización GA non era o alongamento ou a división celular, senón só a anisotropía do crecemento, o que é consistente cun efecto directo de GA na dirección da división celular no IPR. Non obstante, non podemos descartar que este efecto tamén poida ser indirecto, por exemplo, mediado polo abrandamento da parede celular inducido por GA56. Os cambios nas propiedades da parede celular inducen estrés mecánico57,58, que tamén pode influír na orientación do plano de división celular ao afectar a orientación dos microtúbulos corticais39,46,59. Os efectos combinados do estrés mecánico inducido por GA e a regulación directa da orientación dos microtúbulos por GA poden estar implicados na xeración dun patrón específico de orientación da división celular no IPR para definir os internodos, e necesítanse máis estudos para probar esta idea. Do mesmo xeito, estudos previos destacaron a importancia das proteínas TCP14 e 15 que interactúan con DELLA no control da formación de internodos60,61 e estes factores poden mediar a acción de GA xunto con BREVIPEDICELLUS (BP) e PENNYWISE (PNY), que regulan o desenvolvemento dos internodos e demostrouse que inflúen na sinalización de GA2,62. Dado que os DELLA interactúan coas vías de sinalización de brasinoesteroides, etileno, ácido xasmónico e ácido abscísico (ABA)63,64 e que estas hormonas poden influír na orientación dos microtúbulos65, os efectos do GA na orientación da división celular tamén poden estar mediados por outras hormonas.
Os primeiros estudos citolóxicos demostraron que tanto as rexións internas como as externas da SAM de Arabidopsis son necesarias para o desenvolvemento dos internodos2,42. O feito de que o GA regule activamente a división celular nos tecidos internos12 apoia unha dobre función do GA na regulación do tamaño do meristema e do internodo na SAM. O patrón de división celular direccional tamén está estritamente regulado no tecido SAM interno, e esta regulación é esencial para o crecemento do talo52. Será interesante examinar se o GA tamén xoga un papel na orientación do plano de división celular na organización da SAM interna, sincronizando así a especificación e o desenvolvemento dos internodos dentro da SAM.
As plantas cultiváronse in vitro en solo ou en medio 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) suplementado con sacarosa ao 1 % e ágar (Sigma) ao 1 % en condicións estándar (16 h de luz, 22 °C), agás para os experimentos de crecemento de hipocótilos e raíces nos que as mudas cultiváronse en placas verticais con luz constante e a 22 °C. Para os experimentos con nitratos, as plantas cultiváronse en medio MS modificado (medio para plantas bioWORLD) suplementado con nitrato axeitado (KNO3 0 ou 10 mM), succinato de NH4 0,5 mM, sacarosa ao 1 % e ágar A (Sigma) ao 1 % en condicións de día longo.
O ADNc de GID1a inserido en pDONR221 recombinouse con pDONR P4-P1R-pUBQ10 e pDONR P2R-P3-mCherry en pB7m34GW para xerar pUBQ10::GID1a-mCherry. O ADN de IDD2 inserido en pDONR221 recombinouse en pB7RWG266 para xerar p35S:IDD2-RFP. Para xerar pGID1b::2xmTQ2-GID1b, amplificáronse primeiro un fragmento de 3,9 kb augas arriba da rexión codificante de GID1b e un fragmento de 4,7 kb que contiña o ADNc de GID1b (1,3 kb) e o terminador (3,4 kb) usando os cebadores da Táboa Suplementaria 3 e despois inseriuse en pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) e pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respectivamente, e finalmente recombinouse con pDONR221 2xmTQ268 no vector diana pGreen 012567 usando a clonación Gateway. Para xerar pCUC2::LSSmOrange, a secuencia promotora de CUC2 (3229 pb augas arriba de ATG) seguida da secuencia codificante de mOrange desprazado por Stokes grande (LSSmOrange)69 co sinal de localización nuclear N7 e o terminador transcricional NOS foron ensembladas no vector de direccionamento da kanamicina pGreen usando o sistema de recombinación de 3 fragmentos Gateway (Invitrogen). O vector binario da planta introduciuse na cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens e nas follas de Nicotiana benthamiana mediante o método de infiltración de Agrobacterium e en Arabidopsis thaliana Col-0 mediante o método de inmersión floral, respectivamente. Os genes pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry e pCLV3::mCherry-NLS qmRGA illáronse das proxenies F3 e F1 dos respectivos cruzamentos, respectivamente.
A hibridación in situ do ARN realizouse en puntas de brotes de aproximadamente 1 cm de lonxitude72, que se recolleron e fixaron inmediatamente en solución de FAA (3,7 % de formaldehido, 5 % de ácido acético, 50 % de etanol) prearrefriada a 4 °C. Despois de 2 tratamentos ao baleiro de 15 minutos, cambiouse o fixador e as mostras incubáronse durante a noite. Os ADNc de GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 e RGL3 e as sondas antisentido para os seus 3'-UTR sintetizáronse empregando os cebadores que se mostran na Táboa Suplementaria 3, tal como se describe en Rosier et al.73. As sondas marcadas con digoxixenina foron inmunodetectadas usando anticorpos contra a digoxixenina (dilución de 3000 veces; Roche, número de catálogo: 11 093 274 910) e as seccións foron tinguidas cunha solución de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP, dilución de 250 veces)/nitroazul tetrazolio (NBT, dilución de 200 veces).
Data de publicación: 10 de febreiro de 2025