O crecemento do meristemo apical de brotes (SAM) é fundamental para a arquitectura do talo. Hormonas vexetaisxiberelinas(GAs) desempeñan un papel clave na coordinación do crecemento das plantas, pero o seu papel no SAM segue sendo pouco coñecido. Aquí, desenvolvemos un biosensor ratiométrico de sinalización GA mediante a enxeñaría da proteína DELLA para suprimir a súa función reguladora esencial na resposta transcripcional GA preservando a súa degradación tras o recoñecemento de GA. Demostramos que este biosensor baseado na degradación rexistra con precisión os cambios nos niveis de GA e na detección celular durante o desenvolvemento. Usamos este biosensor para mapear a actividade de sinalización GA no SAM. Demostramos que os sinais de GA altos están presentes predominantemente nas células situadas entre os primordios de órganos, que son precursores das células entre nudos. Usando enfoques de ganancia e perda de función, demostramos ademais que GA regula a orientación do plano de división celular, establecendo a organización celular canónica dos entrenudos, promovendo así a especificación dos entrenudos no SAM.
O meristema apical do brote (SAM), situado no ápice do brote, contén un nicho de células nai cuxa actividade xera órganos laterais e nós nai de forma modular e iterativa ao longo da vida da planta. Cada unha destas unidades repetitivas, ou nós vexetais, inclúe entrenudos e órganos laterais nos nós, e meristemos axilares nas axilas das follas1. O crecemento e a organización dos nós vexetais cambia durante o desenvolvemento. En Arabidopsis, o crecemento internodal suprime durante a fase vexetativa e os meristemos axilares permanecen latentes nas axilas das follas rosetas. Durante a transición á fase floral, o SAM convértese no meristemo da inflorescencia, xerando entrenudos alongados e xemas axilares, ramificacións nas axilas das follas caulinais e, posteriormente, flores sen follas2. Aínda que fixemos avances significativos na comprensión dos mecanismos que controlan o inicio de follas, flores e ramas, sábese relativamente pouco sobre como xorden os entrenudos.
Comprender a distribución espazo-temporal dos GA axudará a comprender mellor as funcións destas hormonas en diferentes tecidos e en diferentes etapas de desenvolvemento. A visualización da degradación da fusión RGA-GFP expresada baixo a acción do seu propio promotor proporciona información importante sobre a regulación dos niveis totais de GA nas raíces15,16. Non obstante, a expresión de RGA varía entre os tecidos17 e está regulada por GA18. Así, a expresión diferencial do promotor RGA pode producir o patrón de fluorescencia observado con RGA-GFP e, polo tanto, este método non é cuantitativo. Máis recentemente, o GA19,20 marcado con fluoresceína bioactiva (Fl) revelou a acumulación de GA no endocórtex da raíz e a regulación dos seus niveis celulares mediante o transporte de GA. Recentemente, o sensor GA FRET nlsGPS1 mostrou que os niveis de GA se correlacionan co alongamento celular nas raíces, filamentos e hipocótilos de crecemento escuro21. Non obstante, como vimos, a concentración de GA non é o único parámetro que controla a actividade de sinalización de GA, xa que depende de procesos de detección complexos. Aquí, partindo da nosa comprensión das vías de sinalización DELLA e GA, informamos do desenvolvemento e caracterización dun biosensor ratiométrico baseado na degradación para a sinalización de GA. Para desenvolver este biosensor cuantitativo, utilizamos un RGA mutante sensible a GA que se fusionou a unha proteína fluorescente e se expresou de forma ubicua nos tecidos, así como unha proteína fluorescente insensible a GA. Amosamos que as fusións de proteínas RGA mutantes non interfiren coa sinalización GA endóxena cando se expresan de xeito ubicuo, e que este biosensor pode cuantificar a actividade de sinalización resultante tanto da entrada de GA como do procesamento do sinal GA polo aparello de detección cunha alta resolución espazo-temporal. Usamos este biosensor para mapear a distribución espazo-temporal da actividade de sinalización de GA e cuantificar como a GA regula o comportamento celular na epiderme SAM. Demostramos que a GA regula a orientación do plano de división das células SAM situadas entre os primordios dos órganos, definindo así a organización celular canónica do entrenudo.
Finalmente, preguntamos se qmRGA podería informar cambios nos niveis de GA endóxeno usando hipocótilos en crecemento. Anteriormente demostramos que o nitrato estimula o crecemento aumentando a síntese de GA e, á súa vez, a degradación de DELLA34. En consecuencia, observamos que a lonxitude do hipocótilo nas mudas pUBQ10::qmRGA cultivadas baixo abundante subministración de nitrato (10 mM NO3-) era significativamente maior que a das mudas cultivadas en condicións de deficiencia de nitratos (figura complementaria 6a). En consonancia coa resposta de crecemento, os sinais de GA foron máis altos nos hipocótilos de mudas cultivadas en condicións de 10 mM de NO3- que nas mudas cultivadas en ausencia de nitrato (figura complementaria 6b, c). Así, qmRGA tamén permite o seguimento dos cambios na sinalización de GA inducidos por cambios endóxenos na concentración de GA.
Para comprender se a actividade de sinalización de GA detectada por qmRGA depende da concentración de GA e da percepción de GA, como se esperaba en función do deseño do sensor, analizamos a expresión dos tres receptores GID1 nos tecidos vexetativos e reprodutivos. Nas mudas, a liña de reporteiros GID1-GUS mostrou que GID1a e c estaban moi expresados en cotiledóns (Fig. 3a-c). Ademais, os tres receptores expresáronse nas follas, os primordios da raíz lateral, as puntas das raíces (agás a tapa radicular de GID1b) e o sistema vascular (Fig. 3a-c). No SAM da inflorescencia, detectamos sinais GUS só para GID1b e 1c (figuras complementarias 7a-c). A hibridación in situ confirmou estes patróns de expresión e demostrou ademais que GID1c se expresou uniformemente a niveis baixos no SAM, mentres que GID1b mostrou unha expresión máis elevada na periferia do SAM (figura complementaria 7d-l). A fusión translacional pGID1b::2xmTQ2-GID1b tamén revelou un rango graduado de expresión de GID1b, desde unha expresión baixa ou nula no centro do SAM ata unha expresión elevada nos bordes do órgano (figura complementaria 7m). Así, os receptores GID1 non se distribúen uniformemente entre e dentro dos tecidos. En experimentos posteriores, tamén observamos que a sobreexpresión de GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) aumentou a sensibilidade de qmRGA en hipocótilos á aplicación externa de GA (Fig. 3d, e). Pola contra, a fluorescencia medida por qd17mRGA no hipocótilo era insensible ao tratamento con GA3 (Fig. 3f, g). Para ambos os ensaios, as mudas foron tratadas con altas concentracións de GA (100 μM GA3) para avaliar o comportamento rápido do sensor, onde se mellorou ou se perdeu a capacidade de unirse ao receptor GID1. Xuntos, estes resultados confirman que o biosensor qmRGA cumpre unha función combinada como sensor GA e GA e suxiren que a expresión diferencial do receptor GID1 pode modular significativamente a emisividade do sensor.
Ata a data, a distribución dos sinais GA no SAM segue sen estar clara. Polo tanto, usamos plantas que expresan qmRGA e o reporteiro de células nai pCLV3::mCherry-NLS35 para calcular mapas cuantitativos de alta resolución da actividade de sinalización GA, centrándose na capa L1 (epiderme; Fig. 4a, b, ver Métodos e métodos complementarios), xa que a L1 xoga un papel clave no control do crecemento SAM3. Aquí, a expresión pCLV3::mCherry-NLS proporcionou un punto de referencia xeométrico fixo para analizar a distribución espazo-temporal da actividade de sinalización GA37. Aínda que a GA se considera esencial para o desenvolvemento dos órganos laterales4, observamos que os sinais de GA eran baixos no primordio floral (P) a partir da etapa P3 (Fig. 4a, b), mentres que os primordios novos P1 e P2 tiñan unha actividade moderada similar á da rexión central (Fig. 4a, b). Detectouse unha actividade de sinalización de GA maior nos límites do primordio do órgano, comezando en P1 / P2 (aos lados do límite) e alcanzando un máximo en P4, así como en todas as células da rexión periférica situadas entre os primordios (Fig. 4a, b e Fig. 8a, b complementaria). Esta maior actividade de sinalización de GA observouse non só na epiderme senón tamén nas capas L2 e L3 superior (figura complementaria 8b). O patrón de sinais GA detectados no SAM usando qmRGA tamén se mantivo sen cambios ao longo do tempo (figura complementaria 8c-f, k). Aínda que a construción qd17mRGA foi sistemáticamente regulada á baixa no SAM das plantas T3 a partir de cinco liñas independentes que caracterizamos en detalle, puidemos analizar os patróns de fluorescencia obtidos coa construción pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (figura complementaria 8g–j, l). Nesta liña de control, só se detectaron cambios menores na relación de fluorescencia no SAM, pero no centro SAM observamos unha diminución clara e inesperada de VENUS asociada a TagBFP. Isto confirma que o patrón de sinalización observado por qmRGA reflicte a degradación dependente de GA de mRGA-VENUS, pero tamén demostra que qmRGA pode sobreestimar a actividade de sinalización de GA no centro do meristemo. En resumo, os nosos resultados revelan un patrón de sinalización GA que reflicte principalmente a distribución dos primordios. Esta distribución da rexión inter-primordial (IPR) débese ao establecemento gradual dunha actividade de sinalización GA elevada entre o primordio en desenvolvemento e a rexión central, mentres que ao mesmo tempo a actividade de sinalización de GA no primordio diminúe (Fig. 4c, d).
A distribución dos receptores GID1b e GID1c (ver arriba) suxire que a expresión diferencial dos receptores GA axuda a configurar o patrón de actividade de sinalización de GA no SAM. Preguntámonos se podería estar implicada a acumulación diferencial de GA. Para investigar esta posibilidade, utilizamos o sensor nlsGPS1 GA FRET21. Detectouse un aumento da frecuencia de activación no SAM de nlsGPS1 tratado con 10 μM GA4 + 7 durante 100 min (figura complementaria 9a-e), o que indica que nlsGPS1 responde aos cambios na concentración de GA no SAM, como ocorre nas raíces21. A distribución espacial da frecuencia de activación de nlsGPS1 revelou niveis de GA relativamente baixos nas capas exteriores do SAM, pero mostrou que estaban elevados no centro e nos bordos do SAM (figura 4e e figura complementaria 9a, c). Isto suxire que GA tamén se distribúe no SAM cun patrón espacial comparable ao revelado por qmRGA. Como enfoque complementario, tamén tratamos o SAM con GA fluorescente (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ou Fl só como control negativo. O sinal Fl distribuíuse por todo o SAM, incluíndo a rexión central e o primordio, aínda que a unha intensidade máis baixa (figura 4j e figura complementaria 10d). En cambio, os tres GA-Fl acumuláronse especificamente dentro dos límites do primordio e en diferentes graos no resto do IPR, con GA7-Fl acumulándose no dominio máis grande do IPR (Fig. 4k e Fig. 10a, b complementaria). A cuantificación da intensidade da fluorescencia revelou que a relación de intensidade IPR e non IPR era maior no SAM tratado con GA-Fl en comparación co SAM tratado con Fl (figura 4l e figura complementaria 10c). Xuntos, estes resultados suxiren que a GA está presente en concentracións máis altas nas células IPR que están situadas máis preto do borde do órgano. Isto suxire que o patrón de actividade de sinalización de SAM GA resulta tanto da expresión diferencial dos receptores de GA como da acumulación diferencial de GA nas células IPR preto dos bordos dos órganos. Así, a nosa análise revelou un patrón espazo-temporal inesperado de sinalización GA, con menor actividade no centro e primordio do SAM e maior actividade no IPR na rexión periférica.
Para comprender o papel da actividade de sinalización diferencial de GA no SAM, analizamos a correlación entre a actividade de sinalización de GA, a expansión celular e a división celular mediante imaxes en tempo real do SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Dado o papel da GA na regulación do crecemento, esperábase unha correlación positiva cos parámetros de expansión celular. Polo tanto, primeiro comparamos os mapas de actividade de sinalización de GA con mapas da taxa de crecemento da superficie celular (como proxy da forza da expansión celular para unha determinada célula e para as células fillas na división) e con mapas de anisotropía de crecemento, que mide a direccionalidade da expansión celular (tamén usado aquí para unha determinada célula e para as células fillas na división; Fig. 5a, b, ver Métodos e métodos complementarios). Os nosos mapas da taxa de crecemento da superficie celular SAM son consistentes coas observacións anteriores38,39, con taxas de crecemento mínimas na fronteira e taxas de crecemento máximas no desenvolvemento de flores (Fig. 5a). A análise de compoñentes principais (PCA) mostrou que a actividade de sinalización de GA estaba correlacionada negativamente coa intensidade de crecemento da superficie celular (figura 5c). Tamén demostramos que os principais eixes de variación, incluíndo a entrada de sinalización GA e a intensidade de crecemento, eran ortogonais á dirección determinada pola alta expresión de CLV3, confirmando a exclusión de células do centro SAM nas análises restantes. A análise de correlación de Spearman confirmou os resultados da PCA (Figura 5d), o que indica que os sinais de GA máis altos no IPR non provocaron unha maior expansión celular. Non obstante, a análise de correlación revelou unha lixeira correlación positiva entre a actividade de sinalización de GA e a anisotropía do crecemento (Figura 5c, d), o que suxire que a sinalización de GA máis alta no IPR inflúe na dirección do crecemento celular e posiblemente na posición do plano de división celular.
a, b Mapas térmicos do crecemento medio da superficie (a) e da anisotropía do crecemento (b) en SAM promediaron en sete plantas independentes (utilizados como indicadores da forza e da dirección da expansión celular, respectivamente). c A análise da PCA incluíu as seguintes variables: sinal GA, intensidade de crecemento superficial, anisotropía de crecemento superficial e expresión de CLV3. O compoñente 1 de PCA estaba principalmente correlacionado negativamente coa intensidade de crecemento da superficie e correlacionado positivamente co sinal GA. O compoñente 2 de PCA estivo principalmente correlacionado positivamente coa anisotropía do crecemento superficial e correlacionouse negativamente coa expresión de CLV3. As porcentaxes representan a variación explicada por cada compoñente. d Análise de correlación de Spearman entre o sinal GA, a intensidade do crecemento superficial e a anisotropía do crecemento superficial a escala de tecidos excluíndo CZ. O número da dereita é o valor rho de Spearman entre dúas variables. Os asteriscos indican casos nos que a correlación/correlación negativa é moi significativa. e Visualización 3D de células Col-0 SAM L1 mediante microscopía confocal. As novas paredes celulares formadas no SAM (pero non no primordio) ás 10 h coréñense segundo os seus valores de ángulo. A barra de cores móstrase na esquina inferior dereita. O recuadro mostra a imaxe 3D correspondente ás 0 h. O experimento repetiuse dúas veces con resultados similares. f Os diagramas de caixa mostran as taxas de división celular en SAM Col-0 IPR e non IPR (n = 10 plantas independentes). A liña central mostra a mediana e os límites das caixas indican os percentiles 25 e 75. Os bigotes indican os valores mínimos e máximos determinados co software R. Os valores de P obtivéronse coa proba t de dúas colas de Welch. g, h Diagrama esquemático que mostra (g) como medir o ángulo da nova parede celular (maxenta) con respecto á dirección radial desde o centro da SAM (liña de puntos brancos) (só se consideran valores de ángulo agudo, é dicir, 0-90°), e (h) as direccións circunferenciais/lateral e radial dentro do meristema. i Histogramas de frecuencia da orientación do plano de división celular a través do SAM (azul escuro), IPR (azul medio) e non IPR (azul claro), respectivamente. Os valores de P obtivéronse mediante unha proba de Kolmogorov-Smirnov de dúas colas. O experimento repetiuse dúas veces con resultados similares. j Histogramas de frecuencia da orientación do plano de división celular do IPR arredor de P3 (verde claro), P4 (verde medio) e P5 (verde escuro), respectivamente. Os valores de P obtivéronse mediante unha proba de Kolmogorov-Smirnov de dúas colas. O experimento repetiuse dúas veces con resultados similares.
Polo tanto, a continuación investigamos a correlación entre a sinalización GA e a actividade da división celular identificando as paredes celulares recentemente formadas durante o ensaio (Fig. 5e). Este enfoque permitiunos medir a frecuencia e a dirección da división celular. Sorprendentemente, descubrimos que a frecuencia das divisións celulares no IPR e no resto do SAM (non IPR, Fig. 5f) era similar, o que indica que as diferenzas na sinalización GA entre as células IPR e non IPR non afectan significativamente á división celular. Isto, e a correlación positiva entre a sinalización de GA e a anisotropía do crecemento, levounos a considerar se a actividade de sinalización de GA podería influír na orientación do plano de división celular. Medimos a orientación da nova parede celular como un ángulo agudo en relación ao eixe radial que conecta o centro do meristemo e o centro da nova parede celular (Fig. 5e-i) e observamos unha clara tendencia das células a dividirse en ángulos próximos a 90° en relación ao eixe radial, sendo as frecuencias máis altas observadas a 70–80°, 28 % e 28. (Fig. 5e,i), correspondentes ás divisións celulares na dirección circunferencial/transversal (Fig. 5h). Para examinar a contribución da sinalización GA a este comportamento da división celular, analizamos os parámetros da división celular no IPR e non IPR por separado (Fig. 5i). Observamos que a distribución do ángulo de división nas células IPR difería da que se produciu nas células non IPR ou nas células de todo o SAM, con células IPR que presentaban unha maior proporción de divisións celulares laterais/circulares, é dicir, 70-80° e 80-90° (33,86% e 30,71%, respectivamente, proporcións correspondentes fig. 5i). Así, as nosas observacións revelaron unha asociación entre a alta sinalización de GA e unha orientación do plano de división celular próxima á dirección circunferencial, similar á correlación entre a actividade de sinalización de GA e a anisotropía do crecemento (Fig. 5c, d). Para establecer aínda máis a conservación espacial desta asociación, medimos a orientación do plano de división nas células IPR que rodean o primordio a partir de P3, xa que a maior actividade de sinalización GA foi detectada nesta rexión a partir de P4 (Fig. 4). Os ángulos de división do IPR ao redor de P3 e P4 non mostraron diferenzas estatisticamente significativas, aínda que se observou un aumento da frecuencia de divisións celulares laterais no IPR ao redor de P4 (Fig. 5j). Non obstante, nas células IPR ao redor de P5, a diferenza na orientación do plano de división celular tornouse estatisticamente significativa, cun forte aumento da frecuencia das divisións celulares transversais (Fig. 5j). Xuntos, estes resultados suxiren que a sinalización GA pode controlar a orientación das divisións celulares no SAM, o que é consistente con informes anteriores40,41 de que a sinalización GA elevada pode inducir a orientación lateral das divisións celulares no IPR.
Prevese que as células do IPR non se incorporarán aos primordios senón aos entrenudos2,42,43. A orientación transversal das divisións celulares no IPR pode producir a organización típica de filas lonxitudinais paralelas de células epidérmicas nos entrenudos. As nosas observacións descritas anteriormente suxiren que a sinalización GA probablemente xoga un papel neste proceso ao regular a dirección da división celular.
A perda de función de varios xenes DELLA dá lugar a unha resposta constitutiva de GA, e os mutantes della poden usarse para probar esta hipótese44. Primeiro analizamos os patróns de expresión de cinco xenes DELLA no SAM. A fusión transcripcional da liña GUS45 revelou que GAI, RGA, RGL1 e RGL2 (en moita menor medida) se expresaban no SAM (figura complementaria 11a-d). A hibridación in situ demostrou ademais que o ARNm GAI se acumula especificamente nos primordios e nas flores en desenvolvemento (figura complementaria 11e). O ARNm RGL1 e RGL3 detectáronse en todo o dosel SAM e en flores máis vellas, mentres que o ARNm RGL2 era máis abundante na rexión fronteriza (figura complementaria 11f-h). As imaxes confocales de pRGL3::RGL3-GFP SAM confirmaron a expresión observada pola hibridación in situ e mostraron que a proteína RGL3 se acumula na parte central do SAM (figura complementaria 11i). Usando a liña pRGA::GFP-RGA, tamén descubrimos que a proteína RGA se acumula no SAM, pero a súa abundancia diminúe no límite a partir de P4 (figura complementaria 11j). Notablemente, os patróns de expresión de RGL3 e RGA son consistentes coa actividade de sinalización GA máis elevada no IPR, tal e como detecta qmRGA (Fig. 4). Ademais, estes datos indican que todos os DELLA están expresados no SAM e que a súa expresión abarca colectivamente todo o SAM.
A continuación analizamos os parámetros de división celular no SAM de tipo salvaxe (Ler, control) e no gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 da quintuple (globais) mutantes (Fig. 6a, b). Curiosamente, observamos un cambio estatisticamente significativo na distribución das frecuencias do ángulo de división celular no SAM mutante global en comparación co tipo salvaxe (Fig. 6c). Este cambio no mutante della global debeuse a un aumento da frecuencia de ángulos de 80-90° (34,71% fronte a 24,55%) e, en menor medida, ángulos de 70-80° (23,78% fronte a 20,18%), é dicir, correspondentes ás divisións celulares transversais (Fig. 6c). A frecuencia de divisións non transversais (0-60 °) tamén foi menor no mutante della global (Fig. 6c). A frecuencia das divisións celulares transversais aumentou significativamente no SAM do mutante global della (Fig. 6b). A frecuencia das divisións celulares transversais no IPR tamén foi maior no mutante della global en comparación co tipo salvaxe (Fig. 6d). Fóra da rexión IPR, o tipo salvaxe tiña unha distribución máis uniforme dos ángulos de división celular, mentres que o mutante della global prefería divisións tanxenciais como a IPR (Fig. 6e). Tamén cuantificamos a orientación das divisións celulares no SAM de mutantes quintuples de ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 e ga2ox6-2), un fondo mutante inactivo de GA no que se acumula GA. En consonancia co aumento dos niveis de GA, o SAM da inflorescencia mutante ga2ox quíntupla foi maior que a de Col-0 (figura complementaria 12a, b) e, en comparación co Col-0, o SAM ga2ox quíntuple mostrou unha distribución claramente diferente dos ángulos de división celular, coa frecuencia do ángulo aumentando de 50 ° a división tanxencial de 50 °, favorecendo de novo a división tanxencial 90 °. Fig. 12a–c). Así, mostramos que a activación constitutiva da sinalización de GA e a acumulación de GA inducen divisións celulares laterais no IPR e no resto do SAM.
a, b Visualización en 3D da capa L1 de Ler (a) e mutante global della (b) SAM teñido con PI mediante microscopía confocal. As novas paredes celulares formadas no SAM (pero non no primordio) durante un período de 10 h móstranse e cóllense segundo os seus valores de ángulo. O recuadro mostra o SAM ás 0 h. A barra de cores móstrase na esquina inferior dereita. A frecha en (b) apunta a un exemplo de ficheiros de cela aliñados no mutante global della. O experimento repetiuse dúas veces con resultados similares. ce comparación da distribución de frecuencias das orientacións do plano de división celular en todo o SAM (d), IPR (e) e non IPR (f) entre Ler e global della. Os valores de p obtivéronse mediante unha proba de Kolmogorov-Smirnov de dúas colas. f, g Visualización 3D de imaxes confocais de plantas transxénicas SAM tinguidas con PI de Col-0 (i) e pCUC2::gai-1-VENUS (j). Os paneis (a, b) mostran novas paredes celulares (pero non primordios) formadas no SAM dentro de 10 h. O experimento repetiuse dúas veces con resultados similares. h–j Comparación da distribución de frecuencias das orientacións do plano de división celular localizadas en todo o SAM (h), IPR (i) e non IPR (j) entre as plantas Col-0 e pCUC2::gai-1-VENUS. Os valores de P obtivéronse mediante unha proba de Kolmogorov-Smirnov de dúas colas.
A continuación probamos o efecto da inhibición da sinalización GA específicamente no IPR. Para este fin, utilizamos o promotor da copa de cotiledón 2 (CUC2) para impulsar a expresión dunha proteína gai-1 negativa dominante fusionada con VENUS (na liña pCUC2::gai-1-VENUS). No SAM de tipo salvaxe, o promotor CUC2 impulsa a expresión da maioría dos IPR no SAM, incluídas as células limítrofes, desde P4 en diante, e observouse unha expresión específica similar nas plantas pCUC2::gai-1-VENUS (ver a continuación). A distribución dos ángulos de división celular a través do SAM ou IPR das plantas pCUC2::gai-1-VENUS non era significativamente diferente da do tipo salvaxe, aínda que de forma inesperada descubrimos que as células sen IPR nestas plantas dividíanse cunha frecuencia máis alta de 80-90 ° (Fig. 6f-j).
Suxeriuse que a dirección da división celular depende da xeometría do SAM, en particular da tensión de tracción xerada pola curvatura do tecido46. Polo tanto, preguntamos se a forma do SAM foi alterada nas plantas mutantes della global e pCUC2::gai-1-VENUS. Como se informou anteriormente12, o tamaño do SAM mutante global della era maior que o do tipo salvaxe (figuras complementarias 13a, b, d). A hibridación in situ do ARN CLV3 e STM confirmou a expansión do meristema nos mutantes della e mostrou ademais a expansión lateral do nicho de células nai (figura complementaria 13e, f, h, i). Non obstante, a curvatura SAM foi similar en ambos os xenotipos (figura complementaria 13k, m, n, p). Observamos un aumento similar de tamaño no gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della cuádruple mutante sen un cambio na curvatura en comparación co tipo salvaxe (Figura complementaria 13c, d, g, j, l, o, p). A frecuencia da orientación da división celular tamén se viu afectada no mutante cuádruple della, pero en menor medida que no mutante monolítico della (figura complementaria 12d-f). Este efecto de dosificación, xunto coa falta de efecto sobre a curvatura, suxire que a actividade RGL3 residual no mutante cuádruple Della limita os cambios na orientación da división celular causados pola perda da actividade DELLA e que os cambios nas divisións celulares laterais ocorren en resposta a cambios na actividade de sinalización GA en lugar de cambios na xeometría SAM. Como se describiu anteriormente, o promotor CUC2 impulsa a expresión de IPR no SAM a partir de P4 (figura complementaria 14a, b) e, pola contra, o pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM tiña un tamaño reducido pero unha curvatura máis alta (figura complementaria 14c-h). Este cambio na morfoloxía de pCUC2::gai-1-VENUS SAM pode producir unha distribución diferente das tensións mecánicas en comparación co tipo salvaxe, no que as tensións circunferenciais altas comezan a unha distancia máis curta do centro SAM47. Alternativamente, os cambios na morfoloxía de pCUC2::gai-1-VENUS SAM poden resultar de cambios nas propiedades mecánicas rexionais inducidas pola expresión do transxénico48. En ambos os casos, isto podería compensar parcialmente os efectos dos cambios na sinalización GA aumentando a probabilidade de que as células se dividan na orientación circunferencial/transversal, explicando as nosas observacións.
En conxunto, os nosos datos confirman que a sinalización de GA máis alta xoga un papel activo na orientación lateral do plano de división celular no IPR. Tamén mostran que a curvatura do meristema tamén inflúe na orientación do plano de división celular no IPR.
A orientación transversal do plano de división no IPR, debido á alta actividade de sinalización de GA, suxire que GA preorganiza un ficheiro de células radiais na epiderme dentro do SAM para definir a organización celular que máis tarde se atopará no entrenudo epidérmico. De feito, estes ficheiros celulares eran frecuentemente visibles nas imaxes SAM dos mutantes globais (Fig. 6b). Así, para explorar aínda máis a función de desenvolvemento do patrón espacial de sinalización GA no SAM, utilizamos imaxes de lapso de tempo para analizar a organización espacial das células no IPR en plantas transxénicas de tipo salvaxe (Ler e Col-0), della global mutantes e pCUC2::gai-1-VENUS.
Descubrimos que qmRGA mostrou que a actividade de sinalización GA no IPR aumentou a partir de P1/P2 e alcanzou o seu máximo en P4, e este patrón mantívose constante ao longo do tempo (Fig. 4a-f e Fig. 8c-f complementaria, k). Para analizar a organización espacial das células no IPR co sinal de GA crecente, etiquetamos células Ler IPR por riba e aos lados de P4 segundo o seu destino de desenvolvemento analizado 34 h despois da primeira observación, é dicir, máis de dous tempos de plastidio, o que nos permite seguir as células IPR durante o desenvolvemento do primordio de P1/P2 a P4. Usamos tres cores diferentes: amarela para aquelas células que estaban integradas no primordio preto de P4, verde para as que estaban no IPR e morada para as que participaron en ambos os procesos (Fig. 7a-c). En t0 (0 h), 1-2 capas de células IPR eran visibles diante de P4 (Fig. 7a). Como era de esperar, cando estas células se dividiron, fixérono principalmente a través do plano de división transversal (figuras 7a-c). Resultados similares obtivéronse usando Col-0 SAM (concentrado en P3, cuxo borde se prega de forma similar a P4 en Ler), aínda que neste xenotipo o pregamento formado no borde floral ocultaba as células IPR máis rapidamente (Fig. 7g-i). Así, o patrón de división das células IPR preorganiza as células en filas radiais, como nos entrenudos. A organización das filas radiais e a localización das células IPR entre órganos sucesivos suxiren que estas células son proxenitoras internodais.
Aquí, desenvolvemos un biosensor de sinalización de GA ratiométrico, qmRGA, que permite o mapeamento cuantitativo da actividade de sinalización de GA resultante das concentracións combinadas de receptores de GA e GA mentres minimiza a interferencia coas vías de sinalización endóxenas, proporcionando así información sobre a función de GA a nivel celular. Para iso, construímos unha proteína DELLA modificada, mRGA, que perdeu a capacidade de unirse aos socios de interacción DELLA pero segue sendo sensible á proteólise inducida por GA. qmRGA responde aos cambios tanto esóxenos como endóxenos nos niveis de GA, e as súas propiedades de detección dinámica permiten avaliar os cambios espazotemporais na actividade de sinalización de GA durante o desenvolvemento. qmRGA tamén é unha ferramenta moi flexible xa que se pode adaptar a diferentes tecidos cambiando o promotor usado para a súa expresión (se é necesario), e dada a natureza conservada da vía de sinalización GA e do motivo PFYRE a través das anxiospermas, é probable que sexa transferible a outras especies22. En consonancia con isto, tamén se demostrou que unha mutación equivalente na proteína DELLA de arroz SLR1 (HYY497AAA) suprime a actividade represora do crecemento de SLR1 mentres só reduce lixeiramente a súa degradación mediada por GA, de forma similar á mRGA23. En particular, estudos recentes en Arabidopsis demostraron que unha soa mutación de aminoácidos no dominio PFYRE (S474L) alteraba a actividade transcripcional de RGA sen afectar a súa capacidade de interactuar cos compañeiros do factor de transcrición50. Aínda que esta mutación está moi próxima ás substitucións de 3 aminoácidos presentes no mRGA, os nosos estudos mostran que estas dúas mutacións alteran características distintas de DELLA. Aínda que a maioría dos socios do factor de transcrición únense aos dominios LHR1 e SAW de DELLA26,51, algúns aminoácidos conservados no dominio PFYRE poden axudar a estabilizar estas interaccións.
O desenvolvemento de internodos é un trazo clave na arquitectura da planta e na mellora do rendemento. qmRGA revelou unha maior actividade de sinalización de GA nas células proxenitoras do internodo IPR. Ao combinar imaxes cuantitativas e xenética, demostramos que os patróns de sinalización GA superpoñen planos de división celular circular/transversal na epiderme SAM, configurando a organización da división celular necesaria para o desenvolvemento dos entrenudos. Durante o desenvolvemento identificáronse varios reguladores da orientación do plano de división celular52,53. O noso traballo proporciona un exemplo claro de como a actividade de sinalización GA regula este parámetro celular. DELLA pode interactuar cos complexos de proteínas do pregamento previo41, polo que a sinalización GA pode regular a orientación do plano de división celular ao influír directamente na orientación dos microtúbulos corticais40,41,54,55. Demostramos de forma inesperada que en SAM, o correlato dunha maior actividade de sinalización de GA non era o alongamento nin a división celular, senón só a anisotropía do crecemento, o que é consistente cun efecto directo da GA na dirección da división celular no IPR. Non obstante, non podemos excluír que este efecto tamén poida ser indirecto, por exemplo, mediado polo ablandamento da parede celular inducido por GA56. Os cambios nas propiedades da parede celular inducen estrés mecánico57,58, que tamén pode influír na orientación do plano de división celular ao afectar a orientación dos microtúbulos corticais39,46,59. Os efectos combinados do estrés mecánico inducido por GA e a regulación directa da orientación dos microtúbulos por GA poden estar implicados na xeración dun patrón específico de orientación da división celular no IPR para definir entrenudos, e son necesarios máis estudos para probar esta idea. Do mesmo xeito, estudos anteriores destacaron a importancia das proteínas que interactúan con DELLA TCP14 e 15 no control da formación de entrenudos60,61 e estes factores poden mediar na acción de GA xunto con BREVIPEDICELLUS (BP) e PENNYWISE (PNY), que regulan o desenvolvemento dos entrenudos e demostrouse que inflúen na sinalización de GA2,62. Dado que os DELLA interactúan coas vías de sinalización de brassinosteroides, etileno, ácido xasmónico e ácido abscísico (ABA)63,64 e que estas hormonas poden influír na orientación dos microtúbulos65, os efectos da GA na orientación da división celular tamén poden estar mediados por outras hormonas.
Os primeiros estudos citolóxicos demostraron que tanto as rexións internas como as externas do SAM de Arabidopsis son necesarias para o desenvolvemento dos entrenudos2,42. O feito de que GA regule activamente a división celular nos tecidos internos12 admite unha dobre función da GA na regulación do tamaño do meristema e dos entrenudos no SAM. O patrón de división celular direccional tamén está estreitamente regulado no tecido SAM interno, e esta regulación é esencial para o crecemento do tronco52. Será interesante examinar se a GA tamén xoga un papel na orientación do plano de división celular na organización interna do SAM, sincronizando así a especificación e desenvolvemento dos entrenós dentro do SAM.
As plantas cultiváronse in vitro en solo ou 1x medio Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) complementado con 1% de sacarosa e 1% de agar (Sigma) en condicións estándar (16 h de luz, 22 °C), excepto para experimentos de crecemento de raíces e hipocotilo nos que as mudas se cultivaron en placas verticais a luz constante e 22 °C. Para experimentos con nitrato, as plantas cultiváronse en medio MS modificado (medio vexetal bioWORLD) complementado con nitrato adecuado (0 ou 10 mM KNO3), succinato NH4 0,5 mM, sacarosa ao 1% e ágar A 1% (Sigma) en condicións de longo día.
O ADNc de GID1a inserido en pDONR221 recombinouse con pDONR P4-P1R-pUBQ10 e pDONR P2R-P3-mCherry en pB7m34GW para xerar pUBQ10::GID1a-mCherry. O ADN IDD2 inserido en pDONR221 recombinouse en pB7RWG266 para xerar p35S:IDD2-RFP. Para xerar pGID1b::2xmTQ2-GID1b, un fragmento de 3,9 kb augas arriba da rexión codificante GID1b e un fragmento de 4,7 kb que contén o ADNc de GID1b (1,3 kb) e o terminador (3,4 kb) foron primeiro amplificados usando os cebadores da Táboa complementaria P1R e despois PR4 inseridos na Táboa complementaria P1R Scientific) e pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respectivamente, e finalmente recombináronse con pDONR221 2xmTQ268 no vector obxectivo pGreen 012567 mediante a clonación de Gateway. Para xerar pCUC2::LSSmOrange, a secuencia promotora CUC2 (3229 pb augas arriba de ATG) seguida da secuencia codificante de gran mOrange desplazado por Stokes (LSSmOrange)69 co sinal de localización nuclear N7 e o terminador transcripcional NOS foron ensamblados no vector de recombinación do sistema de recombinación de canamicina Gateway3. (Invitrogen). O vector binario da planta foi introducido na cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens e introducido nas follas de Nicotiana benthamiana polo método de infiltración de Agrobacterium e en Arabidopsis thaliana Col-0 polo método de inmersión floral, respectivamente. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry e pCLV3::mCherry-NLS qmRGA foron illados das proxenies F3 e F1 dos cruces respectivos, respectivamente.
A hibridación in situ do ARN realizouse en puntas de brotes de aproximadamente 1 cm de lonxitude72, que foron recollidas e fixadas inmediatamente en solución de FAA (3,7% de formaldehido, 5% de ácido acético, 50% de etanol) pre-enfriada a 4 °C. Despois de tratamentos ao baleiro de 2 × 15 min, cambiouse o fixador e incubáronse as mostras durante a noite. Sintetizáronse os ADNc GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 e RGL3 e as sondas antisentido para os seus 3′-UTR utilizando os cebadores que se mostran na Táboa complementaria 3 segundo o descrito por Rosier et al.73. As sondas marcadas con digoxixenina foron inmunodetectadas mediante anticorpos contra digoxixenina (dilución de 3000 veces; Roche, número de catálogo: 11 093 274 910) e as seccións tinguironse con fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP, 250 veces tetrazolium, 250 veces). dilución 200 veces).
Hora de publicación: 10-feb-2025