As proteínas DELLA consérvansereguladores de crecementoque desempeñan un papel central no desenvolvemento das plantas en resposta a sinais internos e externos. Como reguladores transcricionais, os DELLA únense aos factores de transcrición (TF) e á histona H2A a través dos seus dominios GRAS e son recrutados para actuar sobre os promotores. Estudos recentes demostraron que a estabilidade de DELLA está regulada postraducionalmente por dous mecanismos: a poliubiquitinación inducida pola hormona vexetalxiberelina, o que leva á súa rápida degradación e á conxugación cun pequeno modificador de tipo ubiquitina (SUMO), que aumenta a súa acumulación. Ademais, a actividade de DELLA está regulada dinamicamente por dous mecanismos de glicosilación distintos: a O-fucosilación potencia a interacción DELLA-TF, mentres que a modificación da N-acetilglicosamina ligada a O (O-GlcNAc) inhibe a interacción DELLA-TF. Non obstante, o papel da fosforilación de DELLA non está claro, xa que estudos previos mostraron resultados contraditorios, con algúns que suxiren que a fosforilación promove ou reprime a degradación de DELLA e outros que a fosforilación non afecta á súa estabilidade. Aquí, identificamos sitios de fosforilación no represor GA1-3 (RGA), AtDELLA, purificado de Arabidopsis thaliana por espectrometría de masas e mostramos que a fosforilación de dous péptidos RGA nas rexións PolyS e PolyS/T potencia a actividade de RGA ao promover a unión a H2A e a asociación de RGA cos promotores diana. Cabe destacar que a fosforilación non afectou ás interaccións RGA-TF nin á estabilidade de RGA. O noso estudo revela un mecanismo molecular polo cal a fosforilación induce a actividade de DELLA.
A nosa análise espectrométrica de masas revelou que tanto Pep1 como Pep2 estaban altamente fosforilados en RGA no fondo Ga1 deficiente en GA. Ademais deste estudo, os estudos fosfoproteómicos tamén revelaron a fosforilación de Pep1 en RGA, aínda que o seu papel aínda non se estudou53,54,55. En contraste, a fosforilación de Pep2 non se describiu previamente, xa que este péptido só se puido detectar usando o transxén RGAGKG. Aínda que a mutación m1A, que aboliu a fosforilación de Pep1, só reduciu lixeiramente a actividade de RGA en planta, tivo un efecto aditivo cando se combinou con m2A na redución da actividade de RGA (Figura suplementaria 6). É importante destacar que a fosforilación de Pep1 reduciuse significativamente no mutante sly1 potenciado por GA en comparación con ga1, o que suxire que GA promove a desfosforilación de RGA, reducindo a súa actividade. O mecanismo polo cal GA suprime a fosforilación de RGA require máis investigación. Unha posibilidade é que isto se consiga mediante a regulación dunha proteína quinase non identificada. Aínda que os estudos demostraron que a expresión da proteína quinase CK1 EL1 está regulada á baixa por GA no arroz41, os nosos resultados indican que as mutacións de orde superior do homólogo EL1 de Arabidopsis (AEL1-4) non reducen a fosforilación de RGA. De acordo cos nosos resultados, un estudo fosfoproteómico recente con liñas que sobreexpresan AEL en Arabidopsis e un mutante triplo ael non identificou ningunha proteína DELLA como substrato destas quinases56. Cando preparamos o manuscrito, informouse de que GSK3, o xene que codifica unha quinase similar a GSK3/SHAGGY no trigo (Triticum aestivum), pode fosforilar a DELLA (Rht-B1b)57, aínda que a fosforilación de Rht-B1b por GSK3 non se confirmou in planta. As reaccións encimáticas in vitro en presenza de GSK3 seguidas de análise de espectrometría de masas revelaron tres sitios de fosforilación situados entre os dominios DELLA e GRAS de Rht-B1b (Figura suplementaria 3). As substitucións de serina por alanina nos tres sitios de fosforilación resultaron nunha diminución da actividade de Rht-B1b no trigo transxénico, o que coincide cos nosos achados de que as substitucións de alanina en Pep2 RGA diminuíron a actividade de RGA. Non obstante, os ensaios de degradación de proteínas in vitro demostraron aínda máis que a fosforilación tamén pode estabilizar Rht-B1b57. Isto contrasta cos nosos resultados que mostran que as substitucións de alanina en Pep2 RGA non alteran a súa estabilidade in plant. GSK3 no trigo é un ortólogo da proteína 2 insensible a brasinoesteroides (BIN2) en Arabidopsis 57. BIN2 é un regulador negativo da sinalización BR e BR activa a súa vía de sinalización ao causar a degradación de BIN2 58. Demostramos que o tratamento con BR non reduce a estabilidade de RGA 59 nin os niveis de fosforilación en Arabidopsis (Figura suplementaria 2), o que suxire que é improbable que RGA sexa fosforilada por BIN2.
Todos os datos cuantitativos foron analizados estatisticamente con Excel e as diferenzas significativas determináronse mediante a proba t de Student. Non se empregaron métodos estatísticos para predeterminar o tamaño da mostra. Non se excluíron datos da análise; o experimento non foi aleatorizado; e os investigadores eran conscientes da asignación durante o experimento e a avaliación dos resultados. Os tamaños das mostras indícanse nas lendas das figuras e nos ficheiros de datos brutos.
Data de publicación: 15 de abril de 2025