As proteínas DELLA consérvansereguladores do crecementoque xogan un papel central no desenvolvemento das plantas en resposta a sinais internos e externos. Como reguladores da transcrición, os DELLA únense aos factores de transcrición (TF) e á histona H2A a través dos seus dominios GRAS e son recrutados para actuar sobre promotores. Estudos recentes demostraron que a estabilidade de DELLA está regulada posttraduccionalmente por dous mecanismos: a poliubiquitinación inducida pola hormona vexetal.xiberelina, o que leva á súa rápida degradación, e á conxugación con pequeno modificador semellante á ubiquitina (SUMO), que aumenta a súa acumulación. Ademais, a actividade de DELLA está regulada dinámicamente por dous mecanismos de glicosilación distintos: a O-fucosilación mellora a interacción DELLA-TF, mentres que a modificación da N-acetilglucosamina ligada a O (O-GlcNAc) inhibe a interacción DELLA-TF. Non obstante, o papel da fosforilación DELLA non está claro xa que estudos anteriores mostraron resultados contradictorios, algúns suxiren que a fosforilación promove ou reprime a degradación de DELLA e outros suxiren que a fosforilación non afecta a súa estabilidade. Aquí, identificamos sitios de fosforilación no represor GA1-3 (RGA), AtDELLA, purificado de Arabidopsis thaliana mediante espectrometría de masas e demostramos que a fosforilación de dous péptidos RGA nas rexións PolyS e PolyS/T mellora a actividade RGA promovendo a unión de H2A e a asociación de RGA con promotores diana. Cabe destacar que a fosforilación non afectou ás interaccións RGA-TF nin á estabilidade da RGA. O noso estudo revela un mecanismo molecular polo cal a fosforilación induce a actividade DELLA.
A nosa análise espectrométrica de masas revelou que tanto Pep1 como Pep2 estaban altamente fosforilados en RGA nun fondo de Ga1 deficiente en GA. Ademais deste estudo, os estudos fosfoproteómicos tamén revelaron a fosforilación de Pep1 en RGA, aínda que aínda non se estudou o seu papel53,54,55. Pola contra, a fosforilación de Pep2 non foi descrita previamente xa que este péptido só se puido detectar mediante o transxene RGAGKG. Aínda que a mutación m1A, que aboliu a fosforilación de Pep1, só reduciu lixeiramente a actividade RGA na planta, tivo un efecto aditivo cando se combinaba con m2A na redución da actividade RGA (Figura 6 complementaria). É importante destacar que a fosforilación de Pep1 reduciuse significativamente no mutante sly1 mellorado con GA en comparación co ga1, o que suxire que a GA promove a desfosforilación de RGA, reducindo a súa actividade. O mecanismo polo cal GA suprime a fosforilación de RGA require máis investigación. Unha posibilidade é que isto se consiga mediante a regulación dunha proteína quinase non identificada. Aínda que os estudos demostraron que a expresión da proteína quinase CK1 EL1 está regulada á baixa pola GA no arroz41, os nosos resultados indican que as mutacións de orde superior do homólogo EL1 de Arabidopsis (AEL1-4) non reducen a fosforilación de RGA. De acordo cos nosos resultados, un estudo fosfoproteómico recente que utilizou liñas de sobreexpresión de AEL de Arabidopsis e un mutante triple ael non identificou ningunha proteína DELLA como substrato destas quinases56. Cando preparamos o manuscrito, informouse de que GSK3, o xene que codifica unha quinase similar a GSK3/SHAGY no trigo (Triticum aestivum), pode fosforilar DELLA (Rht-B1b)57, aínda que a fosforilación de Rht-B1b por GSK3 non foi confirmada en planta. As reaccións enzimáticas in vitro en presenza de GSK3 seguidas dunha análise de espectrometría de masas revelaron tres sitios de fosforilación situados entre os dominios DELLA e GRAS de Rht-B1b (figura complementaria 3). As substitucións de serina a alanina nos tres sitios de fosforilación provocaron unha diminución da actividade de Rht-B1b no trigo transxénico, de acordo cos nosos descubrimentos de que as substitucións de alanina en Pep2 RGA diminuíron a actividade de RGA. Non obstante, os ensaios de degradación de proteínas in vitro demostraron ademais que a fosforilación tamén pode estabilizar o Rht-B1b57. Isto contrasta cos nosos resultados que mostran que as substitucións de alanina en Pep2 RGA non alteran a súa estabilidade na planta. GSK3 no trigo é un ortólogo da proteína 2 insensible aos brassinosteroides (BIN2) en Arabidopsis 57. BIN2 é un regulador negativo da sinalización BR, e BR activa a súa vía de sinalización causando a degradación de BIN2 58. Demostramos que o tratamento con BR non reduce a estabilidade da RGA 59 nin a fosforilación, o que suxire que os niveis de supplementación de RGA2 son os niveis de Arabidopsis (RGA2). é improbable que sexa fosforilado por BIN2.
Todos os datos cuantitativos foron analizados estatisticamente mediante Excel e as diferenzas significativas determináronse mediante a proba t de Student. Non se utilizaron métodos estatísticos para predeterminar o tamaño da mostra. Non se excluíron datos da análise; o experimento non foi aleatorizado; e os investigadores eran conscientes da asignación durante o experimento e a avaliación dos resultados. Os tamaños de mostra ofrécense nas lendas das figuras e nos ficheiros de datos brutos.
Hora de publicación: 15-Abr-2025