Este estudo avaliou a letalidade, a subletalidade e a toxicidade dos produtos comerciaiscipermetrinaformulacións para cágados anuros. Na proba aguda, analizáronse concentracións de 100–800 μg/L durante 96 h. Na proba crónica, analizáronse concentracións de cipermetrina natural (1, 3, 6 e 20 μg/L) para determinar a mortalidade, seguidas de probas de micronúcleos e anomalías nucleares dos glóbulos vermellos durante 7 días. A CL50 da formulación comercial de cipermetrina para cágados foi de 273,41 μg L−1. Na proba crónica, a concentración máis alta (20 μg L−1) deu lugar a unha mortalidade superior ao 50 %, xa que matou a metade dos cágados analizados. A proba de micronúcleos mostrou resultados significativos a 6 e 20 μg L−1 e detectáronse varias anomalías nucleares, o que indica que a formulación comercial de cipermetrina ten potencial xenotóxico contra P. gracilis. A cipermetrina supón un alto risco para esta especie, o que indica que pode causar múltiples problemas e afectar a dinámica deste ecosistema a curto e longo prazo. Polo tanto, pódese concluír que as formulacións comerciais de cipermetrina teñen efectos tóxicos sobre P. gracilis.
Debido á continua expansión das actividades agrícolas e á aplicación intensiva decontrol de pragasmedidas, os animais acuáticos están expostos con frecuencia a pesticidas1,2. A contaminación dos recursos hídricos preto dos campos agrícolas pode afectar o desenvolvemento e a supervivencia de organismos non obxectivo, como os anfibios.
Os anfibios son cada vez máis importantes na avaliación das matrices ambientais. Os anuros considéranse bos bioindicadores de contaminantes ambientais debido ás súas características únicas, como os ciclos de vida complexos, as rápidas taxas de crecemento larvario, o estado trófico, a pel permeable10,11, a dependencia da auga para a reprodución12 e os ovos desprotexidos11,13,14. A ra pequena de auga (Physalaemus gracilis), coñecida comunmente como ra chorona, demostrouse que é unha especie bioindicadora de contaminación por pesticidas4,5,6,7,15. A especie atópase en augas estancadas, zonas protexidas ou zonas con hábitat variable na Arxentina, Uruguai, Paraguai e Brasil1617 e considérase estable pola clasificación da UICN debido á súa ampla distribución e tolerancia a diferentes hábitats18.
Informáronse de efectos subletais en anfibios tras a exposición á cipermetrina, incluíndo cambios de comportamento, morfolóxicos e bioquímicos nos cágados23,24,25, alteración da mortalidade e do tempo de metamorfose, cambios encimáticos, diminución do éxito de eclosión24,25, hiperactividade26, inhibición da actividade da colinesterase27 e cambios no rendemento da natación7,28. Non obstante, os estudos sobre os efectos xenotóxicos da cipermetrina nos anfibios son limitados. Polo tanto, é importante avaliar a susceptibilidade das especies de anuros á cipermetrina.
A contaminación ambiental afecta o crecemento e desenvolvemento normais dos anfibios, pero o efecto adverso máis grave é o dano xenético ao ADN causado pola exposición a pesticidas13. A análise da morfoloxía das células sanguíneas é un bioindicador importante da contaminación e da posible toxicidade dunha substancia para as especies salvaxes29. A proba de micronúcleos é un dos métodos máis utilizados para determinar a xenotoxicidade dos produtos químicos no medio ambiente30. É un método rápido, eficaz e económico que é un bo indicador da contaminación química de organismos como os anfibios31,32 e pode proporcionar información sobre a exposición a contaminantes xenotóxicos33.
O obxectivo deste estudo foi avaliar o potencial tóxico das formulacións comerciais de cipermetrina para pequenos cágados acuáticos mediante unha proba de micronúcleos e unha avaliación de riscos ecolóxicos.
Mortalidade acumulada (%) de cágados de P. gracilis expostos a diferentes concentracións de cipermetrina comercial durante o período agudo da proba.
Mortalidade acumulada (%) de cágados de P. gracilis expostos a diferentes concentracións de cipermetrina comercial durante unha proba crónica.
A alta mortalidade observada foi o resultado de efectos xenotóxicos en anfibios expostos a diferentes concentracións de cipermetrina (6 e 20 μg/L), como o evidencia a presenza de micronúcleos (MN) e anomalías nucleares nos eritrocitos. A formación de MN indica erros na mitose e está asociada a unha mala unión dos cromosomas aos microtúbulos, defectos nos complexos proteicos responsables da captación e transporte cromosómicos, erros na segregación cromosómica e erros na reparación de danos no ADN38,39 e pode estar relacionada co estrés oxidativo inducido por pesticidas40,41. Observáronse outras anomalías en todas as concentracións avaliadas. O aumento das concentracións de cipermetrina aumentou as anomalías nucleares nos eritrocitos nun 5 % e un 20 % nas doses máis baixas (1 μg/L) e máis altas (20 μg/L), respectivamente. Por exemplo, os cambios no ADN dunha especie poden ter consecuencias graves tanto para a supervivencia a curto como a longo prazo, o que resulta nun declive da poboación, unha alteración da aptitude reprodutiva, endogamia, perda de diversidade xenética e alteracións nas taxas de migración. Todos estes factores poden afectar á supervivencia e ao mantemento das especies42,43. A formación de anomalías eritroides pode indicar un bloqueo na citocinese, o que resulta nunha división celular anormal (eritrocitos binucleados)44,45; os núcleos multilobulados son protuberancias da membrana nuclear con múltiples lóbulos46, mentres que outras anomalías eritroides poden estar asociadas á amplificación do ADN, como os riles/ampollas nucleares47. A presenza de eritrocitos anucleados pode indicar un transporte de osíxeno deficiente, especialmente en auga contaminada48,49. A apoptose indica a morte celular50.
Outros estudos tamén demostraron os efectos xenotóxicos da cipermetrina. Kabaña et al.51 demostraron a presenza de micronúcleos e cambios nucleares como células binucleadas e células apoptóticas en células de Odontophrynus americanus despois da exposición a altas concentracións de cipermetrina (5000 e 10 000 μg L−1) durante 96 h. A apoptose inducida por cipermetrina tamén se detectou en P. biligonigerus52 e Rhinella arenarum53. Estes resultados suxiren que a cipermetrina ten efectos xenotóxicos nunha variedade de organismos acuáticos e que o ensaio de MN e ENA pode ser un indicador de efectos subletais nos anfibios e pode ser aplicable a especies autóctonas e poboacións salvaxes expostas a tóxicos12.
As formulacións comerciais de cipermetrina supoñen un alto risco ambiental (tanto agudo como crónico), con concentracións elevadas (HQ) que superan o nivel da Axencia de Protección Ambiental dos Estados Unidos (EPA)54, o que pode afectar negativamente á especie se está presente no medio ambiente. Na avaliación do risco crónico, a NOEC para a mortalidade foi de 3 μg L−1, o que confirma que as concentracións atopadas na auga poden supoñer un risco para a especie55. A NOEC letal para as larvas de R. arenarum expostas a unha mestura de endosulfán e cipermetrina foi de 500 μg L−1 despois de 168 h; este valor diminuíu a 0,0005 μg L−1 despois de 336 h. Os autores mostran que canto maior sexa a exposición, menores serán as concentracións prexudiciais para a especie. Tamén é importante destacar que os valores de NOEC foron maiores que os de P. gracilis no mesmo tempo de exposición, o que indica que a resposta da especie á cipermetrina é específica da especie. Ademais, en termos de mortalidade, o valor de CHQ de P. gracilis despois da exposición á cipermetrina alcanzou 64,67, o que é superior ao valor de referencia establecido pola Axencia de Protección Ambiental dos Estados Unidos54, e o valor de CHQ das larvas de R. arenarum tamén foi superior a este valor (CHQ > 388,00 despois de 336 h), o que indica que os insecticidas estudados supoñen un alto risco para varias especies de anfibios. Tendo en conta que P. gracilis require aproximadamente 30 días para completar a metamorfose56, pódese concluír que as concentracións de cipermetrina estudadas poden contribuír ao declive da poboación ao impedir que os individuos infectados entren na fase adulta ou reprodutiva a unha idade temperá.
Na avaliación calculada do risco de micronúcleos e outras anomalías nucleares de eritrocitos, os valores de CHQ oscilaron entre 14,92 e 97,00, o que indica que a cipermetrina tiña un risco xenotóxico potencial para P. gracilis mesmo no seu hábitat natural. Tendo en conta a mortalidade, a concentración máxima de compostos xenobióticos tolerables para P. gracilis foi de 4,24 μg L−1. Non obstante, concentracións tan baixas como 1 μg/L tamén mostraron efectos xenotóxicos. Este feito pode levar a un aumento no número de individuos anormais57 e afectar o desenvolvemento e a reprodución das especies nos seus hábitats, o que leva a un descenso nas poboacións de anfibios.
As formulacións comerciais do insecticida cipermetrina mostraron unha alta toxicidade aguda e crónica para P. gracilis. Observáronse taxas de mortalidade máis elevadas, probablemente debido a efectos tóxicos, como o demostra a presenza de micronúcleos e anomalías nucleares de eritrocitos, especialmente núcleos serrados, núcleos lobulados e núcleos vesiculares. Ademais, as especies estudadas mostraron un aumento dos riscos ambientais, tanto agudos como crónicos. Estes datos, combinados con estudos previos do noso grupo de investigación, mostraron que mesmo diferentes formulacións comerciais de cipermetrina aínda causaban unha diminución das actividades da acetilcolinesterase (AChE) e da butirilcolinesterase (BChE) e do estrés oxidativo58, e provocaban cambios na actividade de natación e malformacións orais59 en P. gracilis, o que indica que as formulacións comerciais de cipermetrina teñen unha alta toxicidade letal e subletal para esta especie. Hartmann et al. 60 descubriron que as formulacións comerciais de cipermetrina eran as máis tóxicas para P. gracilis e outra especie do mesmo xénero (P. cuvieri) en comparación con outros nove pesticidas. Isto suxire que as concentracións legalmente aprobadas de cipermetrina para a protección ambiental poden provocar unha alta mortalidade e un declive da poboación a longo prazo.
Necesítanse máis estudos para avaliar a toxicidade do pesticida para os anfibios, xa que as concentracións atopadas no ambiente poden causar unha alta mortalidade e supoñer un risco potencial para P. gracilis. Deberíase fomentar a investigación sobre as especies de anfibios, xa que os datos sobre estes organismos son escasos, especialmente sobre as especies brasileiras.
A proba de toxicidade crónica durou 168 h (7 días) en condicións estáticas e as concentracións subletais foron: 1, 3, 6 e 20 μg ai L−1. En ambos experimentos, avaliáronse 10 cágados por grupo de tratamento con seis réplicas, para un total de 60 cágados por concentración. Mentres tanto, o tratamento só con auga serviu como control negativo. Cada configuración experimental consistía nunha placa de vidro estéril cunha capacidade de 500 ml e unha densidade de 1 cágado por 50 ml de solución. O matraz cubriuse cunha película de polietileno para evitar a evaporación e aireouse continuamente.
A auga analizouse quimicamente para determinar as concentracións de pesticidas ás 0, 96 e 168 h. Segundo Sabin et al. 68 e Martins et al. 69, as análises realizáronse no Laboratorio de Análise de Pesticidas (LARP) da Universidade Federal de Santa María mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas de triplo cuadrupolo (modelo Varian 1200, Palo Alto, California, EUA). A determinación cuantitativa de pesticidas na auga móstrase como material complementario (Táboa SM1).
Para a proba de micronúcleos (MNT) e a proba de anomalía nuclear dos eritrocitos (ARN), analizáronse 15 cágados de cada grupo de tratamento. Os cágados foron anestesiados con lidocaína ao 5 % (50 mg g-170) e as mostras de sangue recolléronse mediante punción cardíaca utilizando xeringas heparinizadas desbotables. Preparáronse frotis de sangue en láminas de microscopio estériles, secáronse ao aire, fixáronse con metanol ao 100 % (4 °C) durante 2 minutos e despois tinguíronse cunha solución de Giemsa ao 10 % durante 15 minutos na escuridade. Ao final do proceso, as láminas laváronse con auga destilada para eliminar o exceso de tinción e secáronse a temperatura ambiente.
Analizáronse polo menos 1000 eritrocitos de cada cágado cun microscopio de 100× cun obxectivo de 71 para determinar a presenza de MN e ENA. Avaliáronse un total de 75.796 eritrocitos de cágados considerando as concentracións de cipermetrina e os controis. A xenotoxicidade analizouse segundo o método de Carrasco et al. e Fenech et al.38,72 determinando a frecuencia das seguintes lesións nucleares: (1) células anucleadas: células sen núcleo; (2) células apoptóticas: fragmentación nuclear, morte celular programada; (3) células binucleadas: células con dous núcleos; (4) xemas nucleares ou células das ampolas: células con núcleos con pequenas protuberancias da membrana nuclear, ampolas de tamaño similar aos micronúcleos; (5) células cariolizadas: células co contorno do núcleo sen material interno; (6) células con muescas: células con núcleos con gretas ou muescas evidentes na súa forma, tamén chamadas núcleos en forma de ril; (7) células lobuladas: células con protuberancias nucleares maiores que as vesículas mencionadas; e (8) microcélulas: células con núcleos condensados e citoplasma reducido. Os cambios comparáronse cos resultados do control negativo.
Os resultados da proba de toxicidade aguda (LC50) analizáronse empregando o software GBasic e o método TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Os datos da proba crónica foron previamente comprobados para a normalidade do erro (Shapiro-Wilks) e a homoxeneidade da varianza (Bartlett). Os resultados analizáronse mediante unha análise unidireccional da varianza (ANOVA). A proba de Tukey utilizouse para comparar os datos entre si e a proba de Dunnett para comparar os datos entre o grupo de tratamento e o grupo de control negativo.
Os datos de LOEC e NOEC analizáronse mediante a proba de Dunnett. As probas estatísticas realizáronse co software Statistica 8.0 (StatSoft) cun nivel de significación do 95 % (p < 0,05).
Data de publicación: 13 de marzo de 2025