O nematodo do piñeiro é un endoparasito migratorio de corentena que se sabe que causa graves perdas económicas nos ecosistemas dos piñeirais. O presente estudo revisa a actividade nematicida dos indoles haloxenados contra os nematodos do piñeiro e o seu mecanismo de acción. As actividades nematicidas do 5-iodoindol e da avermectina (control positivo) contra os nematodos do piñeiro foron similares e altas a baixas concentracións (10 μg/mL). O 5-iodoindol reduciu a fecundidade, a actividade reprodutiva, a mortalidade embrionaria e larvaria e o comportamento locomotor. As interaccións moleculares dos ligandos con receptores de canles de cloruro específicos de glutamato de invertebrados apoian a idea de que o 5-iodoindol, como a avermectina, únese estreitamente ao sitio activo do receptor. O 5-iodoindol tamén induciu varias deformacións fenotípicas nos nematodos, incluíndo colapso/encollemento anormal de órganos e aumento da vacuolización. Estes resultados suxiren que as vacúolas poden desempeñar un papel na morte mediada pola metilación dos nematodos. É importante destacar que o 5-iodoindol non era tóxico para ambas as especies vexetais (repolo e rabanete). Así, este estudo demostra que a aplicación de iodoindol en condicións ambientais pode controlar a lesión do marchitez do piñeiro.
O nematodo da madeira do piñeiro (Bursaphelenchus xylophilus) pertence aos nematodos da madeira do piñeiro (PWN), nematodos endoparasitarios migratorios que se sabe que causan graves danos ecolóxicos aos ecosistemas dos piñeirais1. A enfermidade do marchitez do piñeiro (PWD) causada polo nematodo da madeira do piñeiro está a converterse nun problema grave en varios continentes, incluíndo Asia e Europa, e en América do Norte, o nematodo destrúe as especies de piñeiro introducidas1,2. O declive do piñeiro é un problema económico importante, e a perspectiva da súa propagación global é preocupante3. As seguintes especies de piñeiros son atacadas con máis frecuencia polo nematodo: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii e Pinus radiata4. O nematodo do piñeiro é unha enfermidade grave que pode matar os piñeiros en semanas ou meses despois da infección. Ademais, os brotes de nematodos do piñeiro son habituais en diversos ecosistemas, polo que se estableceron cadeas de infección persistentes1.
Bursaphelenchus xylophilus é un nematodo vexetal-parasitario de corentena pertencente á superfamilia Aphelenchoidea e ao clado 102.5. O nematodo aliméntase de fungos e reprodúcese nos tecidos da madeira dos piñeiros, desenvolvéndose en catro estadios larvarios diferentes: L1, L2, L3, L4 e un individuo adulto1,6. En condicións de escaseza de alimentos, o nematodo do piñeiro pasa a un estadio larvario especializado - dauer, que parasita o seu vector - o escaravello da casca do piñeiro (Monochamus alternatus) e transfírese a piñeiros sans. Nos hóspedes sans, os nematodos migran rapidamente a través dos tecidos vexetais e aliméntanse de células parenquimatosas, o que leva a unha serie de reaccións de hipersensibilidade, marchamento do piñeiro e morte nun ano despois da infección1,7,8.
O control biolóxico dos nematodos do piñeiro foi un reto durante moito tempo, con medidas de corentena que se remontan ao século XX. As estratexias actuais para controlar os nematodos do piñeiro implican principalmente tratamentos químicos, incluíndo a fumigación de madeira e a implantación de nematicidas nos troncos das árbores. Os nematicidas máis utilizados son a avermectina e o benzoato de avermectina, que pertencen á familia das avermectinas. Estes produtos químicos caros son altamente efectivos contra moitas especies de nematodos e considéranse seguros para o medio ambiente9. Non obstante, espérase que o uso repetido destes nematicidas cree unha presión de selección que case con toda seguridade levará á aparición de nematodos resistentes do piñeiro, como se demostrou para varias pragas de insectos, como Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella e os nematodos Trichostrongylus colubylus e Ostertagia circumcincta, que desenvolveron gradualmente resistencias ás avermeriformis101. Polo tanto, os patróns de resistencia deben ser estudados regularmente e os nematicidas examinados continuamente para atopar medidas alternativas, rendibles e respectuosas co medio ambiente para controlar a PVD. Nas últimas décadas, varios autores propuxeron o uso de extractos vexetais, aceites esenciais e volátiles como axentes de control de nematodos13,14,15,16.
Recentemente demostramos a actividade nematicida do indol, unha molécula de sinalización intercelular e entre reinos, en Caenorhabditis elegans 17 . O indol é un sinal intracelular moi estendido na ecoloxía microbiana, que controla numerosas funcións que afectan á fisioloxía microbiana, á formación de esporas, á estabilidade do plásmido, á resistencia aos fármacos, á formación de biopelículas e á virulencia 18, 19 . Non se estudou a actividade do indol e os seus derivados fronte a outros nematodos patóxenos. Neste estudo, investigamos a actividade nematicida de 34 indoles contra nematodos do piñeiro e dilucidamos o mecanismo de acción do 5-iodoindol máis potente mediante experimentos de microscopía, fotografía time-lapse e acoplamento molecular, e avaliamos os seus efectos tóxicos sobre as plantas mediante un ensaio de xerminación de sementes.
Previamente informouse que altas concentracións (>1,0 mM) de indol teñen un efecto nematicida sobre os nematodos17. Tras o tratamento de B. xylophilus (etapas de vida mixtas) con indol ou 33 derivados diferentes de indol a 1 mM, a mortalidade de B. xylophilus foi medida contando nematodos vivos e mortos nos grupos control e tratados. Cinco indoles mostraron unha actividade nematicida significativa; a supervivencia do grupo control non tratado foi do 95 ± 7% despois de 24 h. Dos 34 indoles probados, o 5-iodoindol e o 4-fluoroindol a 1 mM causaron o 100% de mortalidade, mentres que o 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-carboxilato e 7-iodoindol causaron aproximadamente o 50% de mortalidade (táboa 1).
Efecto do 5-iodoindol na formación de vacuolas e metabolismo do nematodo da madeira de piñeiro. (A) Efecto da avermectina e 5-iodoindol sobre nematodos machos adultos, (B) ovos de nematodos en estadio L1 e (C) metabolismo de B. xylophilus, (i) non se observaron vacúolas ás 0 h, o tratamento deu lugar a (ii) vacúolos, (iii) acumulación de múltiples vacúolos, (iv) fusións de vacuolos e pozos de vacuo, (vi) formación de vacúolas xigantes. As frechas vermellas indican inchazo das vacúolas, as azuis indican a fusión das vacúolas e as frechas negras indican vacúolas xigantes. Barra de escala = 50 μm.
Ademais, este estudo tamén describiu o proceso secuencial da morte inducida polo metano nos nematodos do piñeiro (Figura 4C). A morte metanoxénica é un tipo de morte celular non apoptótica asociada á acumulación de vacúolas citoplásmicas prominentes27. Os defectos morfolóxicos observados nos nematodos do piñeiro parecen estar estreitamente relacionados co mecanismo da morte inducida polo metano. O exame microscópico en diferentes momentos mostrou que se formaron vacúolas xigantes despois de 20 h de exposición a 5-iodoindol (0,1 mM). Observáronse vacúolas microscópicas despois de 8 h de tratamento, e o seu número aumentou despois de 12 h. Observáronse varios vacúolos grandes despois de 14 h. Varias vacuolas fusionadas foron claramente visibles despois de 12-16 h de tratamento, o que indica que a fusión de vacúolas é a base do mecanismo de morte metanoxénica. Despois de 20 horas, atopáronse varias vacúolas xigantes por todo o verme. Estas observacións representan o primeiro informe de metuose en C. elegans .
Nos vermes tratados con 5-iodoindol, tamén se observou a agregación e a rotura de vacúolos (Fig. 5), como se evidencia pola flexión dos vermes e a liberación de vacúolos ao medio. Tamén se observou a interrupción da vacuola na membrana da casca do ovo, que normalmente se conserva intacta por L2 durante a eclosión (figura complementaria S2). Estas observacións apoian a implicación da acumulación de fluídos e da falla osmorreguladora, así como da lesión celular reversible (RCI), no proceso de formación de vacuolas e supuración (Fig. 5).
Asumindo a hipótese do papel do iodo na formación de vacúolas observada, investigamos a actividade nematicida do ioduro de sodio (NaI) e o ioduro de potasio (KI). Non obstante, a concentracións (0,1, 0,5 ou 1 mM), non afectaron nin á supervivencia dos nematodos nin á formación de vacúolas (figura complementaria S5), aínda que 1 mM KI tivo un leve efecto nematicida. Por outra banda, o 7-iodoindol (1 ou 2 mM), como o 5-iodoindole, induciu múltiples vacuolas e deformacións estruturais (figura complementaria S6). Os dous iodoindoles mostraron características fenotípicas similares nos nematodos do piñeiro, mentres que NaI e KI non. Curiosamente, o indol non induciu a formación de vacúolas en B. xylophilus nas concentracións probadas (datos non mostrados). Así, os resultados confirmaron que o complexo indol-iodo é responsable da vacuolización e metabolismo de B. xylophilus.
Entre os indoles probados para a actividade nematicida, o 5-iodoindol tivo o índice de deslizamento máis alto de -5,89 kcal/mol, seguido do 7-iodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindol (-4,33) e indol (-4,03) (Figura 6). O forte enlace de hidróxeno do 5-iodoindol á leucina 218 estabiliza a súa unión, mentres que todos os outros derivados de indol únense á serina 260 mediante enlaces de hidróxeno da cadea lateral. Entre outros iodoindoles modelados, o 2-iodoindol ten un valor de unión de -5,248 kcal/mol, que se debe ao seu enlace de hidróxeno principal coa leucina 218. Outras unións coñecidas inclúen 3-iodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-iodoindol (-4,0 kcal/mol.) e 6 kcal/mol. (Figura complementaria S8). A maioría dos indoles haloxenados e o propio indol, con excepción do 5-iodoindol e do 2-iodoindol, forman un enlace coa serina 260. O feito de que os enlaces de hidróxeno coa leucina 218 sexan indicativos dunha unión eficiente receptor-ligando, como se observa na ivermectina (Figura complementaria S7 e 2-iodoindoi), confirma que o mesmo. a ivermectina, únense firmemente ao sitio activo do receptor GluCL a través da leucina 218 (Fig. 6 e Fig. S8 complementaria). Propoñemos que esta unión é necesaria para manter a estrutura de poro aberto do complexo GluCL e que ao unirse estreitamente ao sitio activo do receptor GluCL, 5-iodoindol, 2-iodoindol, avermectina e ivermectina manteñen a canle iónica aberta e permiten a captación de fluídos.
Acoplamento molecular de indol e indol haloxenado a GluCL. Orientacións de unión dos ligandos (A) indol, (B) 4-fluoroindol, (C) 7-iodoindol e (D) 5-iodoindol ao sitio activo de GluCL. A proteína está representada por unha cinta e os enlaces de hidróxeno da columna vertebral móstranse como liñas de puntos amarelas. (A′), (B′), (C′) e (D′) mostran as interaccións dos ligandos correspondentes cos residuos de aminoácidos circundantes, e os enlaces de hidróxeno da cadea lateral indícanse mediante frechas de puntos rosas.
Realizáronse experimentos para avaliar o efecto tóxico do 5-iodoindol na xerminación das sementes de repolo e rabanete. O 5-iodoindol (0,05 ou 0,1 mM) ou a avermectina (10 μg/mL) tiveron pouco ou ningún efecto na xerminación inicial e na emerxencia das plántulas (Figura 7). Ademais, non se atopou ningunha diferenza significativa entre a taxa de xerminación dos controis non tratados e as sementes tratadas con 5-iodoindol ou avermectina. O efecto sobre o alongamento da raíz principal e o número de raíces laterais formadas foi insignificante, aínda que 1 mM (10 veces a súa concentración activa) de 5-iodoindol atrasou lixeiramente o desenvolvemento das raíces laterais. Estes resultados indican que o 5-iodoindol non é tóxico para as células vexetais e non interfire cos procesos de desenvolvemento das plantas nas concentracións estudadas.
Efecto do 5-iodoindol na xerminación das sementes. Xerminación, brotación e enraizamento lateral de sementes de B. oleracea e R. raphanistrum en medio de agar Murashige e Skoog con ou sen avermectina ou 5-iodoindol. A xerminación rexistrouse despois de 3 días de incubación a 22 °C.
Este estudo informa de varios casos de morte de nematodos por indoles. É importante destacar que este é o primeiro informe de metilación que induce iodoindol (un proceso causado pola acumulación de pequenas vacúolas que se funden gradualmente en vacúolas xigantes, que finalmente conducen á rotura da membrana e á morte) nas agullas de piñeiro, sendo o iodoindol que presenta propiedades nematicidas significativas similares ás do nematicida comercial avermectina.
Previamente informouse que os indoles exercen múltiples funcións de sinalización en procariotas e eucariotas, incluíndo a inhibición/formación de biopelículas, a supervivencia bacteriana e a patoxenicidade19,32,33,34. Recentemente, os potenciais efectos terapéuticos dos indoles haloxenados, alcaloides indol e derivados semisintéticos de indol atraeron un amplo interese de investigación35,36,37. Por exemplo, demostrouse que os indoles haloxenados matan as células persistentes de Escherichia coli e Staphylococcus aureus37. Ademais, é de interese científico estudar a eficacia dos indoles haloxenados fronte a outras especies, xéneros e reinos, e este estudo supón un paso para acadar este obxectivo.
Aquí, propoñemos un mecanismo para a letalidade inducida por 5-iodoindol en C. elegans baseado na lesión celular reversible (RCI) e na metilación (Figuras 4C e 5). Os cambios edematosos como a hinchazón e a dexeneración vacuolar son indicadores de RCI e metilación, que se manifestan como vacúolas xigantes no citoplasma48,49. O RCI interfire coa produción de enerxía reducindo a produción de ATP, causando fallas na bomba de ATPasa ou interrompendo as membranas celulares e provocando un rápido influxo de Na+, Ca2+ e auga50,51,52. As vacúolas intracitoplasmáticas xorden nas células animais como resultado da acumulación de fluídos no citoplasma debido á entrada de Ca2+ e auga53. Curiosamente, este mecanismo de dano celular é reversible se o dano é temporal e as células comezan a producir ATP durante un certo período de tempo, pero se o dano persiste ou empeora, as células morren.54 As nosas observacións mostran que os nematodos tratados con 5-iodoindol non son capaces de restaurar a biosíntese normal despois da exposición a condicións de estrés.
O fenotipo de metilación inducido polo 5-iodoindol en B. xylophilus pode deberse á presenza de iodo e á súa distribución molecular, xa que o 7-iodoindol tivo menos efecto inhibidor sobre B. xylophilus que o 5-iodoindol (táboa 1 e figura complementaria S6). Estes resultados son parcialmente consistentes cos estudos de Maltese et al. (2014), que informaron de que a translocación do resto de nitróxeno piridilo no indol da posición para á meta aboliu a vacuolización, a inhibición do crecemento e a citotoxicidade nas células U251, o que suxire que a interacción da molécula cun sitio activo específico na proteína é crítica27,44,45. As interaccións entre indol ou indoles haloxenados e receptores GluCL observados neste estudo tamén apoian esta noción, xa que se atopou que 5 e 2-iodoindol se unían aos receptores GluCL con máis forza que os outros indoles examinados (figura 6 e figura complementaria S8). Atopouse que o iodo na segunda ou quinta posición do indol se une á leucina 218 do receptor GluCL mediante enlaces de hidróxeno da columna vertebral, mentres que outros indoles haloxenados e o propio indol forman enlaces de hidróxeno débiles de cadea lateral coa serina 260 (Figura 6). Polo tanto, especulamos que a localización do halóxeno xoga un papel importante na indución da dexeneración vacuolar, mentres que a estreita unión do 5-iodoindol mantén aberta a canle iónica, permitindo así a rápida entrada de fluído e a ruptura da vacuola. Non obstante, aínda está por determinar o mecanismo de acción detallado do 5-iodoindol.
Antes da aplicación práctica do 5-iodoindol, débese analizar o seu efecto tóxico sobre as plantas. Os nosos experimentos de xerminación de sementes mostraron que o 5-iodoindol non tiña ningún efecto negativo na xerminación das sementes nin nos procesos de desenvolvemento posteriores nas concentracións estudadas (Figura 7). Así, este estudo proporciona unha base para o uso do 5-iodoindol no medio ecolóxico para controlar a nocividade dos nematodos do piñeiro para os piñeiros.
Informes anteriores demostraron que a terapia baseada en indol representa un enfoque potencial para abordar o problema da resistencia a antibióticos e a progresión do cancro55. Ademais, os indoles posúen actividades antibacterianas, anticanceríxenas, antioxidantes, antiinflamatorias, antidiabéticas, antivirais, antiproliferativas e antituberculosas e poden servir como unha base prometedora para o desenvolvemento de fármacos56,57. Este estudo suxire por primeira vez o uso potencial do iodo como axente antiparasitario e antihelmíntico.
Avermectina foi descuberta hai tres décadas e gañou o Premio Nobel en 2015, e o seu uso como antihelmíntico aínda continúa activamente. Non obstante, debido ao rápido desenvolvemento da resistencia ás avermectinas en nematodos e pragas de insectos, é necesaria unha estratexia alternativa, de baixo custo e respectuosa co medio ambiente para controlar a infección por PWN nos piñeiros. Este estudo tamén informa do mecanismo polo cal o 5-iodoindol mata os nematodos do piñeiro e que o 5-iodoindol ten unha baixa toxicidade para as células vexetais, o que abre boas perspectivas para a súa futura aplicación comercial.
Todos os experimentos foron aprobados polo Comité de Ética da Universidade de Yeungnam, Gyeongsan, Corea, e os métodos realizáronse de acordo coas directrices do Comité de Ética da Universidade de Yeungnam.
Realizáronse experimentos de incubación de ovos mediante procedementos establecidos43. Para avaliar as taxas de eclosión (HR), os nematodos adultos de 1 día de idade (aproximadamente 100 femias e 100 machos) foron transferidos a placas de Petri que contiñan o fungo e deixáronse crecer durante 24 h. Os ovos foron illados e tratados con 5-iodoindol (0,05 mM e 0,1 mM) ou avermectina (10 μg/ml) como suspensión en auga destilada estéril. Estas suspensións (500 μl; aproximadamente 100 ovos) foron transferidas aos pozos dunha placa de cultivo de tecidos de 24 pozos e incubáronse a 22 °C. Os recontos de L2 fixéronse despois de 24 h de incubación pero consideráronse mortos se as células non se movían ao ser estimuladas cun fío fino de platino. Este experimento realizouse en dúas etapas, cada unha con seis repeticións. Combináronse e presentáronse os datos dos dous experimentos. A porcentaxe de HR calcúlase do seguinte xeito:
A mortalidade larvaria avaliouse mediante procedementos desenvolvidos previamente. Recolléronse ovos de nematodos e sincronizáronse os embrións mediante a eclosión en auga destilada estéril para xerar larvas en fase L2. As larvas sincronizadas (aproximadamente 500 nematodos) foron tratadas con 5-iodoindol (0,05 mM e 0,1 mM) ou avermectina (10 μg/ml) e criadas en placas de B. cinerea Petri. Despois de 48 h de incubación a 22 °C, os nematodos foron recollidos en auga destilada estéril e examináronse para detectar a presenza das fases L2, L3 e L4. A presenza dos estadios L3 e L4 indicaba transformación larvaria, mentres que a presenza do estadio L2 indicaba ningunha transformación. As imaxes foron adquiridas mediante o sistema de imaxe celular dixital iRiS™. Este experimento realizouse en dúas etapas, cada unha con seis repeticións. Combináronse e presentáronse os datos dos dous experimentos.
A toxicidade do 5-iodoindol e da avermectina para as sementes avaliouse mediante probas de xerminación en placas de ágar Murashige e Skoog. hipoclorito) durante 15 min, e lavado cinco veces con 1 ml de auga estéril. A continuación, as sementes esterilizadas foron presionadas sobre placas de agar de xerminación que conteñen 0,86 g/l (0,2X) de medio Murashige e Skoog e 0,7% de ágar bacteriolóxico con ou sen 5-iodoindol ou avermectina. Despois incubáronse as placas a 22 °C e tomáronse as imaxes despois de 3 días de incubación. Este experimento realizouse en dúas etapas, cada unha das cales tivo seis repeticións.
Hora de publicación: 26-feb-2025