O nematodo do piñeiro é un endoparasito migratorio de corentena que se sabe que causa graves perdas económicas nos ecosistemas das montañas de piñeiros. O presente estudo revisa a actividade nematicida dos indoles haloxenados contra os nematodos do piñeiro e o seu mecanismo de acción. As actividades nematicidas do 5-iodoindol e a avermectina (control positivo) contra os nematodos do piñeiro foron similares e altas a baixas concentracións (10 μg/mL). O 5-iodoindol reduciu a fecundidade, a actividade reprodutiva, a mortalidade embrionaria e larvaria e o comportamento locomotor. As interaccións moleculares dos ligandos cos receptores de canais de cloruro regulados por glutamato específicos de invertebrados apoian a idea de que o 5-iodoindol, como a avermectina, únese fortemente ao sitio activo do receptor. O 5-iodoindol tamén induciu varias deformacións fenotípicas nos nematodos, incluíndo o colapso/retracción anormal dos órganos e o aumento da vacuolización. Estes resultados suxiren que os vacúolos poden desempeñar un papel na morte mediada por metilación dos nematodos. É importante destacar que o 5-iodoindol non foi tóxico para ningunha das dúas especies vexetais (repolo e ravo). Polo tanto, este estudo demostra que a aplicación de iodoindol en condicións ambientais pode controlar os danos por murcha do piñeiro.
O nematodo da madeira do piñeiro (Bursaphelenchus xylophilus) pertence aos nematodos da madeira do piñeiro (PWN), nematodos endoparasitos migratorios que se sabe que causan graves danos ecolóxicos aos ecosistemas das piñeiros1. A enfermidade da murcha do piñeiro (PWD) causada polo nematodo da madeira do piñeiro está a converterse nun problema grave en varios continentes, incluíndo Asia e Europa, e en América do Norte, o nematodo destrúe as especies de piñeiro introducidas1,2. O declive dos piñeiros é un importante problema económico e a perspectiva da súa propagación global é preocupante3. As seguintes especies de piñeiro son atacadas con máis frecuencia polo nematodo: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii e Pinus radiata4. O nematodo do piñeiro é unha enfermidade grave que pode matar os piñeiros en cuestión de semanas ou meses despois da infección. Ademais, os brotes de nematodos do piñeiro son comúns nunha variedade de ecosistemas, polo que se estableceron cadeas de infección persistentes1.
O *Bursaphelenchus xylophilus* é un nematodo fitoparasito de corentena que pertence á superfamilia Aphelenchoidea e ao clado 102.5. O nematodo aliméntase de fungos e reprodúcese nos tecidos leñosos dos piñeiros, desenvolvéndose en catro estadios larvarios diferentes: L1, L2, L3, L4 e un individuo adulto1,6. En condicións de escaseza de alimentos, o nematodo do piñeiro pasa a un estadio larvario especializado (o *dauer*), que parasita o seu vector (o escaravello da cortiza do piñeiro, Monochamus alternatus) e transfírese a piñeiros sans. Nos hóspedes sans, os nematodos migran rapidamente a través dos tecidos vexetais e aliméntanse de células parenquimatosas, o que provoca unha serie de reaccións de hipersensibilidade, murchamento e morte do piñeiro nun ano despois da infección1,7,8.
O control biolóxico dos nematodos do piñeiro foi durante moito tempo un desafío, con medidas de corentena que se remontan ao século XX. As estratexias actuais para controlar os nematodos do piñeiro implican principalmente tratamentos químicos, incluíndo a fumigación da madeira e a implantación de nematicidas nos troncos das árbores. Os nematicidas máis utilizados son a avermectina e o benzoato de avermectina, que pertencen á familia das avermectinas. Estes produtos químicos caros son moi eficaces contra moitas especies de nematodos e considéranse seguros para o medio ambiente9. Non obstante, espérase que o uso repetido destes nematicidas cree unha presión de selección que case con certeza levará á aparición de nematodos do piñeiro resistentes, como se demostrou para varias pragas de insectos, como Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella e os nematodos Trichostrongylus colubriformis e Ostertagia circumcincta, que desenvolveron gradualmente resistencia ás avermectinas10,11,12. Polo tanto, os patróns de resistencia deben estudarse regularmente e os nematicidas deben examinarse continuamente para atopar medidas alternativas, rendibles e respectuosas co medio ambiente para controlar a enfermidade por enfermidades víricas. Nas últimas décadas, varios autores propuxeron o uso de extractos de plantas, aceites esenciais e compostos volátiles como axentes de control de nematodos13,14,15,16.
Recentemente demostramos a actividade nematicida do indol, unha molécula de sinalización intercelular e interreinos, en Caenorhabditis elegans 17. O indol é un sinal intracelular xeneralizado na ecoloxía microbiana, que controla numerosas funcións que afectan á fisioloxía microbiana, a formación de esporas, a estabilidade dos plásmidos, a resistencia aos fármacos, a formación de biopelículas e a virulencia 18, 19. Non se estudou a actividade do indol e os seus derivados contra outros nematodos patóxenos. Neste estudo, investigamos a actividade nematicida de 34 indoles contra os nematodos dos piñeiros e dilucidamos o mecanismo de acción do 5-iodoindol máis potente mediante microscopía, fotografía time-lapse e experimentos de acoplamento molecular, e avaliamos os seus efectos tóxicos nas plantas mediante un ensaio de xerminación de sementes.
Xa se informou previamente de que altas concentracións (>1,0 mM) de indol teñen un efecto nematicida sobre os nematodos17. Tras o tratamento de B. xylophilus (etapas vitais mixtas) con indol ou 33 derivados do indol diferentes a 1 mM, a mortalidade de B. xylophilus mediuse contando os nematodos vivos e mortos nos grupos de control e tratado. Cinco indoles mostraron unha actividade nematicida significativa; a supervivencia do grupo de control non tratado foi do 95 ± 7 % despois de 24 h. Dos 34 indoles probados, o 5-iodoindol e o 4-fluoroindol a 1 mM causaron unha mortalidade do 100 %, mentres que o 5,6-difluoroindigo, o metilindol-7-carboxilato e o 7-iodoindol causaron unha mortalidade de aproximadamente o 50 % (Táboa 1).
Efecto do 5-iodoindol na formación de vacúolos e no metabolismo do nematodo da madeira de piñeiro. (A) Efecto da avermectina e o 5-iodoindol en nematodos machos adultos, (B) ovos de nematodos en estadio L1 e (C) metabolismo de B. xylophilus, (i) non se observaron vacúolos ás 0 h, o tratamento provocou (ii) vacúolos, (iii) acumulación de múltiples vacúolos, (iv) inchazo dos vacúolos, (v) fusión dos vacúolos e (vi) formación de vacúolos xigantes. As frechas vermellas indican inchazo dos vacúolos, as frechas azuis indican fusión dos vacúolos e as frechas negras indican vacúolos xigantes. Barra de escala = 50 μm.
Ademais, este estudo tamén describiu o proceso secuencial de morte inducida por metano en nematodos do piñeiro (Figura 4C). A morte metanoxénica é un tipo non apoptótico de morte celular asociada coa acumulación de vacúolos citoplasmáticos prominentes27. Os defectos morfolóxicos observados nos nematodos do piñeiro parecen estar estreitamente relacionados co mecanismo de morte inducida por metano. O exame microscópico en diferentes momentos mostrou que se formaron vacúolos xigantes despois de 20 h de exposición ao 5-iodoindol (0,1 mM). Observáronse vacúolos microscópicos despois de 8 h de tratamento e o seu número aumentou despois de 12 h. Observáronse varios vacúolos grandes despois de 14 h. Varios vacúolos fusionados eran claramente visibles despois de 12 a 16 h de tratamento, o que indica que a fusión de vacúolos é a base do mecanismo de morte metanoxénica. Despois de 20 horas, atopáronse varios vacúolos xigantes por todo o verme. Estas observacións representan o primeiro informe de metuose en C. elegans.
Nos vermes tratados con 5-iodoindol, tamén se observou agregación e rotura de vacúolos (Fig. 5), como se evidencia pola flexión dos vermes e a liberación de vacúolos ao ambiente. Tamén se observou disrupción de vacúolos na membrana da casca do ovo, que normalmente se conserva intacta por L2 durante a eclosión (Fig. suplementaria S2). Estas observacións apoian a implicación da acumulación de fluídos e a falla osmorreguladora, así como a lesión celular reversible (ICR), no proceso de formación e supuración de vacúolos (Fig. 5).
Formulando a hipótese do papel do iodo na formación de vacúolos observada, investigamos a actividade nematicida do ioduro de sodio (NaI) e do ioduro de potasio (KI). Non obstante, a concentracións (0,1, 0,5 ou 1 mM), non afectaron nin á supervivencia dos nematodos nin á formación de vacúolos (Figura suplementaria S5), aínda que 1 mM de KI tivo un lixeiro efecto nematicida. Por outra banda, o 7-iodoindol (1 ou 2 mM), como o 5-iodoindol, induciu múltiples vacúolos e deformacións estruturais (Figura suplementaria S6). Os dous iodoindoles mostraron características fenotípicas similares nos nematodos dos piñeiros, mentres que NaI e KI non. Curiosamente, o indol non induciu a formación de vacúolos en B. xylophilus ás concentracións probadas (datos non mostrados). Polo tanto, os resultados confirmaron que o complexo indol-iodo é responsable da vacuolización e o metabolismo de B. xylophilus.
Entre os indoles analizados para a súa actividade nematicida, o 5-iodoindol tivo o índice de deslizamento máis alto de -5,89 kcal/mol, seguido do 7-iodoindol (-4,48 kcal/mol), o 4-fluoroindol (-4,33) e o indol (-4,03) (Figura 6). As fortes pontes de hidróxeno da cadea principal do 5-iodoindol á leucina 218 estabilizan a súa unión, mentres que todos os demais derivados do indol únense á serina 260 a través de pontes de hidróxeno na cadea lateral. Entre outros iodoindoles modelados, o 2-iodoindol ten un valor de unión de -5,248 kcal/mol, debido á súa principal ponte de hidróxeno coa leucina 218. Outras unións coñecidas inclúen o 3-iodoindol (-4,3 kcal/mol), o 4-iodoindol (-4,0 kcal/mol) e o 6-fluoroindol (-2,6 kcal/mol) (Figura suplementaria S8). A maioría dos indoles haloxenados e o propio indole, coa excepción do 5-iodoindol e o 2-iodoindol, forman unha unión coa serina 260. O feito de que as pontes de hidróxeno coa leucina 218 sexan indicativas dunha unión eficiente do receptor ao ligando, como se observou para a ivermectina (Fig. suplementaria S7), confirma que o 5-iodoindol e o 2-iodoindol, como a ivermectina, únense fortemente ao sitio activo do receptor GluCL a través da leucina 218 (Fig. 6 e Fig. suplementaria S8). Propoñemos que esta unión é necesaria para manter a estrutura de poros abertos do complexo GluCL e que, ao unirse fortemente ao sitio activo do receptor GluCL, o 5-iodoindol, o 2-iodoindol, a avermectina e a ivermectina manteñen así o canal iónico aberto e permiten a absorción de fluídos.
Acoplamento molecular de indol e indol haloxenado a GluCL. Orientacións de unión dos ligandos (A) indol, (B) 4-fluoroindol, (C) 7-iodoindol e (D) 5-iodoindol ao sitio activo de GluCL. A proteína represéntase cunha cinta e as pontes de hidróxeno da cadea principal móstranse como liñas punteadas amarelas. (A′), (B′), (C′) e (D′) mostran as interaccións dos ligandos correspondentes cos residuos de aminoácidos circundantes e as pontes de hidróxeno da cadea lateral indícanse con frechas punteadas rosas.
Realizáronse experimentos para avaliar o efecto tóxico do 5-iodoindol na xerminación de sementes de col e rabanete. O 5-iodoindol (0,05 ou 0,1 mM) ou a avermectina (10 μg/mL) tiveron pouco ou ningún efecto na xerminación inicial e na emerxencia das plántulas (Figura 7). Ademais, non se atopou ningunha diferenza significativa entre a taxa de xerminación dos controis non tratados e as sementes tratadas con 5-iodoindol ou avermectina. O efecto sobre o alongamento da raíz principal e o número de raíces laterais formadas foi insignificante, aínda que 1 mM (10 veces a súa concentración activa) de 5-iodoindol atrasou lixeiramente o desenvolvemento das raíces laterais. Estes resultados indican que o 5-iodoindol non é tóxico para as células das plantas e non interfire cos procesos de desenvolvemento das plantas nas concentracións estudadas.
Efecto do 5-iodoindol na xerminación das sementes. Xerminación, xerminación e enraizamento lateral das sementes de B. oleracea e R. raphanistrum en medio de ágar Murashige e Skoog con ou sen avermectina ou 5-iodoindol. A xerminación rexistrouse despois de 3 días de incubación a 22 °C.
Este estudo informa de varios casos de morte de nematodos por indoles. É importante destacar que este é o primeiro informe de metilación indutora por iodoindol (un proceso causado pola acumulación de pequenos vacúolos que se fusionan gradualmente en vacúolos xigantes, o que finalmente leva á rotura da membrana e á morte) en agullas de piñeiro, e o iodoindol exhibe propiedades nematicidas significativas similares ás do nematicida comercial avermectina.
Xa se informou previamente de que os indoles exercen múltiples funcións de sinalización en procariotas e eucariotas, incluíndo a inhibición/formación de biopelículas, a supervivencia bacteriana e a patoxenicidade19,32,33,34. Recentemente, os posibles efectos terapéuticos dos indoles haloxenados, os alcaloides indólicos e os derivados semisintéticos do indol atraeron un amplo interese investigador35,36,37. Por exemplo, demostrouse que os indoles haloxenados matan células persistentes de Escherichia coli e Staphylococcus aureus37. Ademais, é de interese científico estudar a eficacia dos indoles haloxenados contra outras especies, xéneros e reinos, e este estudo é un paso cara á consecución deste obxectivo.
Aquí, propoñemos un mecanismo para a letalidade inducida por 5-iodoindol en C. elegans baseado na lesión celular reversible (RCI) e na metilación (Figuras 4C e 5). Os cambios edematosos como a inchazón e a dexeneración vacuolar son indicadores de RCI e metilación, manifestándose como vacúolos xigantes no citoplasma48,49. O RCI interfire coa produción de enerxía ao reducir a produción de ATP, causando unha falla da bomba ATPase ou interrompendo as membranas celulares e causando unha rápida afluencia de Na+, Ca2+ e auga50,51,52. Os vacúolos intracitoplasmáticos xorden nas células animais como resultado da acumulación de fluído no citoplasma debido á afluencia de Ca2+ e auga53. Curiosamente, este mecanismo de dano celular é reversible se o dano é temporal e as células comezan a producir ATP durante un certo período de tempo, pero se o dano persiste ou empeora, as células morren.54 As nosas observacións mostran que os nematodos tratados con 5-iodoindol non son capaces de restaurar a biosíntese normal despois da exposición a condicións de estrés.
O fenotipo de metilación inducido polo 5-iodoindol en B. xylophilus pode deberse á presenza de iodo e á súa distribución molecular, xa que o 7-iodoindol tivo menos efecto inhibitorio sobre B. xylophilus que o 5-iodoindol (Táboa 1 e Figura Suplementaria S6). Estes resultados son parcialmente consistentes cos estudos de Maltese et al. (2014), que informaron de que a translocación da fracción de nitróxeno piridilo no indol desde a posición para á meta aboliu a vacuolización, a inhibición do crecemento e a citotoxicidade nas células U251, o que suxire que a interacción da molécula cun sitio activo específico na proteína é fundamental27,44,45. As interaccións entre o indol ou os indoles haloxenados e os receptores GluCL observadas neste estudo tamén apoian esta noción, xa que se descubriu que o 5- e o 2-iodoindol se unen aos receptores GluCL con máis forza que os outros indoles examinados (Figura 6 e Figura Suplementaria S8). Descubriuse que o iodo na segunda ou quinta posición do indol únese á leucina 218 do receptor GluCL a través de enlaces de hidróxeno na cadea principal, mentres que outros indoles haloxenados e o propio indol forman enlaces de hidróxeno débiles na cadea lateral coa serina 260 (Figura 6). Polo tanto, especulamos que a localización do halóxeno xoga un papel importante na indución da dexeneración vacuolar, mentres que a forte unión do 5-iodoindol mantén o canal iónico aberto, o que permite unha rápida afluencia de fluídos e a rotura do vacúolo. Non obstante, o mecanismo de acción detallado do 5-iodoindol aínda está por determinar.
Antes da aplicación práctica do 5-iodoindol, débese analizar o seu efecto tóxico nas plantas. Os nosos experimentos de xerminación de sementes demostraron que o 5-iodoindol non tivo ningún efecto negativo na xerminación das sementes nin nos procesos de desenvolvemento posteriores nas concentracións estudadas (Figura 7). Polo tanto, este estudo proporciona unha base para o uso do 5-iodoindol no ambiente ecolóxico para controlar a nocividade dos nematodos do piñeiro para os piñeiros.
Informes previos demostraron que a terapia baseada en indol representa unha posible estratexia para abordar o problema da resistencia aos antibióticos e a progresión do cancro55. Ademais, os indoles posúen actividades antibacterianas, anticanceríxenas, antioxidantes, antiinflamatorias, antidiabéticas, antivirais, antiproliferativas e antituberculosas e poden servir como unha base prometedora para o desenvolvemento de fármacos56,57. Este estudo suxire por primeira vez o uso potencial do iodo como axente antiparasitario e antihelmíntico.
A avermectina foi descuberta hai tres décadas e gañou o Premio Nobel en 2015, e o seu uso como antihelmíntico aínda continúa activamente. Non obstante, debido ao rápido desenvolvemento da resistencia ás avermectinas en nematodos e pragas de insectos, necesítase unha estratexia alternativa, de baixo custo e respectuosa co medio ambiente para controlar a infección por PWN nos piñeiros. Este estudo tamén informa do mecanismo polo cal o 5-iodoindol mata os nematodos dos piñeiros e de que o 5-iodoindol ten baixa toxicidade para as células vexetais, o que abre boas perspectivas para a súa futura aplicación comercial.
Todos os experimentos foron aprobados polo Comité de Ética da Universidade de Yeungnam, Gyeongsan, Corea, e os métodos realizáronse de acordo coas directrices do Comité de Ética da Universidade de Yeungnam.
Os experimentos de incubación de ovos realizáronse empregando procedementos establecidos43. Para avaliar as taxas de eclosión (HR), nematodos adultos dun día de idade (aproximadamente 100 femias e 100 machos) transferíronse a placas de Petri que contiñan o fungo e deixáronse crecer durante 24 h. Despois, illáronse os ovos e tratáronse con 5-iodoindol (0,05 mM e 0,1 mM) ou avermectina (10 μg/ml) como suspensión en auga destilada estéril. Estas suspensións (500 μl; aproximadamente 100 ovos) transferíronse aos pozos dunha placa de cultivo de tecidos de 24 pozos e incubáronse a 22 °C. As contagens de L2 realizáronse despois de 24 h de incubación, pero consideráronse mortas se as células non se movían cando se estimulaban cun fío fino de platino. Este experimento realizouse en dúas etapas, cada unha con seis repeticións. Os datos de ambos experimentos combináronse e presentáronse. A porcentaxe de HR calcúlase do seguinte xeito:
A mortalidade larvaria avaliouse empregando procedementos desenvolvidos previamente. Recolléronse ovos de nematodos e os embrións sincronizáronse mediante eclosión en auga destilada estéril para xerar larvas en estadio L2. As larvas sincronizadas (aproximadamente 500 nematodos) tratáronse con 5-iodoindol (0,05 mM e 0,1 mM) ou avermectina (10 μg/ml) e criáronse en placas de Petri de B. cinerea. Despois de 48 h de incubación a 22 °C, recolléronse nematodos en auga destilada estéril e examináronse para detectar a presenza das etapas L2, L3 e L4. A presenza das etapas L3 e L4 indicou transformación larvaria, mentres que a presenza da etapa L2 non indicou transformación. As imaxes adquiríronse empregando o sistema de imaxe celular dixital iRiS™. Este experimento realizouse en dúas etapas, cada unha con seis repeticións. Os datos de ambos experimentos combináronse e presentáronse.
A toxicidade do 5-iodoindol e a avermectina para as sementes avaliouse mediante probas de xerminación en placas de ágar Murashige e Skoog.62 As sementes de B. oleracea e R. raphanistrum mergulláronse primeiro en auga destilada estéril durante un día, laváronse con 1 ml de etanol ao 100 %, esterilizáronse con 1 ml de lixivia comercial ao 50 % (hipoclorito de sodio ao 3 %) durante 15 minutos e laváronse cinco veces con 1 ml de auga estéril. Despois, as sementes esterilizadas presionáronse sobre placas de ágar de xerminación que contiñan 0,86 g/l (0,2X) de medio Murashige e Skoog e 0,7 % de ágar bacteriolóxico con ou sen 5-iodoindol ou avermectina. As placas incubáronse a continuación a 22 °C e tomáronse imaxes despois de 3 días de incubación. Este experimento realizouse en dúas etapas, cada unha das cales tiña seis repeticións.
Data de publicación: 26 de febreiro de 2025