Grazas por visitar Nature.com.A versión do navegador que estás a usar ten soporte CSS limitado.Para obter os mellores resultados, recomendámosche que utilices unha versión máis recente do teu navegador (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, mostramos o sitio sen estilo nin JavaScript.
O descubrimento e o uso beneficioso de produtos naturais poden axudar a mellorar a vida humana.Os produtos químicos inhibidores do crecemento das plantas úsanse amplamente como herbicidas para controlar as malas herbas.Debido á necesidade de utilizar diferentes tipos de herbicidas, existe a necesidade de identificar compostos con novos mecanismos de acción.Neste estudo, descubrimos un novo composto de N-alcoxipirrol, a cumamonamida, de Streptomyces werraensis MK493-CF1 e establecemos o proceso de síntese completo.Mediante ensaios de actividade biolóxica, descubrimos que o ácido urs-monoámico é un intermediario sintético da urs-monoamida e un potencialinhibidor do crecemento das plantas.Ademais, desenvolvemos varios derivados do ácido urbenónico, incluíndo o derivado urbeniloxi (UDA), que ten unha alta actividade herbicida sen afectar negativamente o crecemento das células HeLa.Tamén descubrimos que os derivados do ácido urmotónico alteran os microtúbulos das plantas;ademais, KAND afecta aos filamentos de actina e induce a morte celular;Estes efectos multifacéticos difiren dos dos coñecidos inhibidores de microtúbulos e suxiren un novo mecanismo de acción para o ácido ursónico, que representa unha vantaxe importante no desenvolvemento de novos herbicidas.
O descubrimento e a aplicación práctica de produtos naturais beneficiosos e os seus derivados é un medio para mellorar a calidade de vida humana.Os metabolitos secundarios producidos por microorganismos, plantas e insectos provocaron importantes avances na medicina e na agricultura.Moitos antibióticos e medicamentos contra a leucemia desenvolvéronse a partir de produtos naturais.Ademais, varios tipos depesticidas, deses produtos naturais extráense funxicidas e herbicidas para o seu uso na agricultura.En particular, os herbicidas para o control de herbas daniñas son ferramentas importantes para aumentar o rendemento dos cultivos na agricultura moderna, e xa se utilizan comercialmente varios tipos de compostos.Varios procesos celulares nas plantas, como a fotosíntese, o metabolismo de aminoácidos, a síntese da parede celular, a regulación da mitose, a sinalización de fitohormonas ou a síntese de proteínas, considéranse obxectivos típicos dos herbicidas.Os compostos que inhiben a función dos microtúbulos son unha clase común de herbicidas que afectan o crecemento das plantas ao afectar a regulación mitótica2.
Os microtúbulos son compoñentes do citoesqueleto e consérvanse amplamente nas células eucariotas.O heterodímero de tubulina está formado por α-tubulina e β-tubulina que forman protofilamentos de microtúbulos lineais, con 13 protofilamentos que forman unha estrutura cilíndrica.Os microtúbulos desempeñan múltiples funcións nas células vexetais, incluíndo a determinación da forma celular, a división celular e o transporte intracelular3,4.As células vexetais conteñen microtúbulos debaixo da membrana plasmática de interfase, e pénsase que estes chamados microtúbulos corticais controlan a organización das microfibrillas de celulosa mediante a regulación dos complexos de celulosa sintase4,5.Os microtúbulos corticais das células epidérmicas da raíz, presentes na zona de elongación rápida da punta da raíz, sitúanse lateralmente e as microfibras de celulosa seguen estes microtúbulos e limitan a dirección da expansión celular, promovendo así o alongamento anisotrópico das células.Polo tanto, a función dos microtúbulos está moi relacionada coa morfoloxía das plantas.As substitucións de aminoácidos nos xenes que codifican a tubulina provocan un sesgo das matrices de microtúbulos corticais e un crecemento no lado esquerdo ou dereito en Arabidopsis 6,7.Do mesmo xeito, as mutacións nas proteínas asociadas aos microtúbulos que regulan a dinámica dos microtúbulos tamén poden provocar un crecemento da raíz distorsionado8,9,10,11,12,13.Ademais, o tratamento con herbicidas que alteran os microtúbulos como a disopiramida, tamén coñecida como pretilaclor, tamén provoca o crecemento da raíz oblicua do lado esquerdo14.Estes datos indican que a regulación precisa da función dos microtúbulos é fundamental para determinar a dirección do crecemento das plantas.
Descubríronse varios tipos de inhibidores de microtúbulos, e estes fármacos fixeron contribucións significativas á investigación do citoesqueleto, así como á agricultura e á medicina2.En particular, a orizalina, os compostos de dinitroanilina, a disopiramida, os compostos relacionados coa benzamida e os seus análogos poden inhibir a función dos microtúbulos e, polo tanto, inhibir o crecemento das plantas.Polo tanto, son amplamente utilizados como herbicidas.Non obstante, dado que os microtúbulos son un compoñente importante das células vexetais e animais, a maioría dos inhibidores de microtúbulos son citotóxicos para ambos os tipos celulares.Polo tanto, a pesar da súa recoñecida utilidade como herbicidas, úsase un número limitado de axentes antimicrotúbulos con fins prácticos.
Streptomyces é un xénero da familia Streptomyces, que inclúe bacterias aerobias, grampositivas e filamentosas e é moi coñecido pola súa capacidade para producir unha ampla gama de metabolitos secundarios.Polo tanto, considérase unha das fontes máis importantes de novos produtos naturais bioloxicamente activos.No estudo actual, descubrimos un novo composto chamado cumamonamida, que se illou de Streptomyces werraensis MK493-CF1 e S. werraensis ISP 5486. Usando análise espectral e análise espectral completa, caracterizouse a estrutura da cumamonamida e o seu esqueleto único de N-alcoxipirrol. estaba determinada.síntese.O ácido ursmónico, un intermediario sintético da ursmonoamida e os seus derivados, inhibe o crecemento e a xerminación da popular planta modelo Arabidopsis thaliana.Nun estudo de relación estrutura-actividade, descubrimos que un composto con C9 modificado para ácido ursónico, chamado noniloxi derivado do ácido ursónico (KAND), mellora significativamente o efecto inhibidor sobre o crecemento e a xerminación.Notablemente, o inhibidor de crecemento vexetal recentemente descuberto tamén afectou o crecemento do tabaco e da hepática e non era citotóxico para as bacterias nin para as células HeLa.Ademais, algúns derivados do ácido urmotónico inducen un fenotipo raíz distorsionado, o que implica que estes derivados afectan directa ou indirectamente aos microtúbulos.De acordo con esta idea, as nosas observacións de microtúbulos marcados inmunohistoquímicamente ou con proteínas fluorescentes indican que o tratamento con KAND despolimeriza os microtúbulos.Ademais, o tratamento con derivados do ácido kumamotónico interrompeu os microfilamentos de actina.Así, descubrimos un novo inhibidor do crecemento vexetal cuxo mecanismo único de acción implica a destrución do citoesqueleto.
A cepa MK493-CF1 illouse do solo en Shinagawa-ku, Tokio.A cepa MK493-CF1 formou micelio estromal ben ramificado.Determinouse a secuencia parcial do xene do ARN ribosómico 16S (1422 pb).Esta cepa é moi similar a S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pb, T: cepa típica, 99,93%).En base a este resultado, determinouse que esta cepa estaba moi relacionada coa cepa tipo de S. werraensis.Polo tanto, denominamos provisionalmente esta cepa S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T tamén produce os mesmos compostos bioactivos.Dado que houbo poucas investigacións temperás sobre a obtención de produtos naturais a partir deste microorganismo, realizáronse máis investigacións químicas.Despois do cultivo de S. werraensis MK493-CF1 en medio de cebada mediante fermentación en estado sólido a 30 °C durante 14 días, o medio extraeuse con EtOH ao 50%.Secáronse 60 ml de mostra para obter 59,5 mg de extracto bruto.O extracto bruto foi sometido a HPLC en fase inversa para dar N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida (1, denominada cumamonamida, 36,0 mg).A cantidade total de 1 é aproximadamente o 60% do extracto bruto.Polo tanto, decidimos estudar en detalle as propiedades da kumamotoamida 1.
A coumamonamida 1 é un po amorfo branco e a espectrometría de masas de alta resolución (HRESIMS) confirma C6H8N2O2 (Fig. 1).O fragmento de pirrol substituído en C2 deste composto caracterízase por δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH no espectro de RMN 1H: 4,5 Hz). , H-5) e δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), e o espectro de RMN 13C mostra a presenza de catro átomos de carbono sp2.A presenza dun grupo amida na posición C2 avaliouse mediante a correlación HMBC do protón C-3 ao carbono carbonilo amida en δC 161,1.Ademais, os picos de RMN 1H e 13C en δH 4,10 (3H, S) e δC 68,3 indican a presenza de grupos N-metoxi na molécula.Aínda que a posición correcta do grupo metoxi aínda non se determinara mediante análises espectroscópicas como a espectroscopia de diferenza mellorada e a abreviatura de Overhauser nuclear (NOEDF), a N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida converteuse no primeiro composto candidato.
Para determinar a estrutura correcta de 1, realizouse unha síntese total (Fig. 2a).O tratamento da 2-aminopiridina 2 comercialmente dispoñible con m-CPBA deu como resultado o rendemento cuantitativo do N-óxido 3 correspondente.Despois da 2-aminoazidación de 2, a reacción de ciclocondensación descrita por Abramovich levouse a cabo en benceno a 90 °C para obter o 1-hidroxi-1H-pirrol-2-carbonitrilo desexado 5 en gramos.Velocidade 60% (dúas etapas).15,16.A metilación e hidrólise de 4 deron entón ácido 1-metoxi-1H-pirrol-2-carboxílico (denominado "ácido cumotónico", 6) cun bo rendemento (70 %, dous pasos).Finalmente, a amidación mediante o intermedio de cloruro de ácido 6 usando amoníaco acuoso deu a amida 1 de Kumamoto cun rendemento do 98%.Todos os datos espectrais de 1 sintetizado eran similares aos illados 1, polo que se determinou a estrutura de 1;
Síntese xeral e análise da actividade biolóxica da urbenamida e do ácido urbénico.(a) Síntese total de amida de Kumamoto.(b) Cultiváronse mudas de Arabidopsis Columbia (Col) de tipo salvaxe de sete días en placas de Murashige e Skoog (MS) que conteñan cumamonamida 6 ou cumamonamida 1 nas concentracións indicadas.Barra de escala = 1 cm.
En primeiro lugar, avaliamos as actividades biolóxicas da urbenamida e os seus intermediarios pola súa capacidade para modular o crecemento das plantas.Engadimos varias concentracións de ursmonamida 1 ou ácido ursmónico 6 ao medio de agar MS e cultivamos mudas de Arabidopsis thaliana neste medio.Estes ensaios mostraron que altas concentracións (500 μM) de 6 inhibiron o crecemento das raíces (Fig. 2b).A continuación, xeramos varias derivadas substituíndo a posición N1 de 6 e realizamos estudos de relación estrutura-actividade sobre elas (o proceso de síntese analóxica descríbese na Información de apoio (SI)).As mudas de Arabidopsis cultiváronse nun medio que contén 50 μM de derivados do ácido ursónico e mediuse a lonxitude da raíz.como se mostra na imaxe.Como se mostra nas figuras 3a, b e S1, os ácidos cumamo teñen diferentes lonxitudes de cadeas alcoxi lineais (9, 10, 11, 12 e 13) ou grandes cadeas alcoxi (15, 16 e 17) na posición N1.Os derivados mostraron unha inhibición significativa do crecemento das raíces.Ademais, descubrimos que a aplicación de 200 μM 10, 11 ou 17 inhibiu a xerminación (Figs. 3c e S2).
Estudo da relación estrutura-actividade da amida de Kumamoto e compostos relacionados.(a) Estrutura e esquema de síntese dos análogos.(b) Cuantificación da lonxitude da raíz de mudas de 7 días cultivadas en medio MS con ou sen derivados de cumamonamida 50 μM.Os asteriscos indican diferenzas significativas co tratamento simulado (proba t, p< 0,05).n>18. Os datos móstranse como media ± SD.nt significa "non probado" porque máis do 50% das sementes non xerminaron.(c) Cuantificación da taxa de xerminación das sementes tratadas incubadas durante 7 días en medio MS con ou sen cumamonamida 200 μM e compostos relacionados.Os asteriscos indican diferenzas significativas co tratamento simulado (proba de chi cadrado).n = 96.
Curiosamente, a adición de cadeas laterais de alquilo máis longas que C9 reduciu a actividade inhibidora, o que suxire que os compostos relacionados co ácido kumamotoico requiren cadeas laterais de certo tamaño para exhibir a súa actividade biolóxica.
Dado que a análise da relación estrutura-actividade mostrou que C9 se modificou a ácido ursónico e que o derivado noniloxi do ácido ursónico (en diante KAND 11) era o inhibidor máis eficaz do crecemento das plantas, realizamos unha caracterización máis detallada de KAND 11. Tratamento de Arabidopsis con 50 μM KAND 11 impediu case por completo a xerminación, mentres que as concentracións máis baixas (40, 30, 20 ou 10 μM) de KAND 11 inhibiron o crecemento das raíces dunha forma dependente da dose (Fig. 4a, b).Para probar se KAND 11 afecta a viabilidade dos meristemos radiculares, examinamos os meristemos radiculares tinguidos con ioduro de propidio (PI) e medimos o tamaño da área do meristema.O tamaño do meristema das mudas cultivadas nun medio que contén 25 μM de KAND-11 foi de 151,1 ± 32,5 μm, mentres que o tamaño do meristema das mudas cultivadas nun medio control que contén DMSO foi de 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d) , o que indica que KAND-11 restaura a actividade celular.espallando.Meristema raíz.En consonancia con isto, o tratamento con KAND 11 reduciu a cantidade de marcador de división celular CDKB2; 1p:: CDKB2; 1-GUS sinal no meristema raíz (Fig. 4e) 17 .Estes resultados indican que KAND 11 inhibe o crecemento das raíces ao reducir a actividade de proliferación celular.
Análise do efecto inhibidor dos derivados do ácido urbenónico (derivados de urbeniloxi) no crecemento.(a) Mudas de Col silvestre de 7 días de idade cultivadas en placas MS coas concentracións indicadas de KAND 11. Barra de escala = 1 cm.(b) Cuantificación da lonxitude da raíz.As letras indican diferenzas significativas (Tukey HSD test, p< 0,05).n>16. Os datos móstranse como media ± SD.(c) Microscopía confocal de raíces de Col de tipo salvaxe teñidas con ioduro de propidio cultivadas en placas MS con ou sen 25 μM KAND 11. Os corchetes brancos indican meristema raíz.Barra de escala = 100 µm.(d) Cuantificación do tamaño dos meristemos radiculares (n = 10 a 11).As diferenzas estatísticas determináronse mediante a proba t (p< 0,05).As barras representan o tamaño medio do meristema.(e) Microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) dun meristema raíz que contén a construción CDKB2;1 pro: CDKB2;Tinción de 1-GUS e tinción en mudas de 5 días cultivadas en placas MS con ou sen ensaio KAND de 25 µM.
A fitotoxicidade de KAND 11 foi máis probada usando outra planta dicotiledónea, o tabaco (Nicotiana tabacum) e un importante organismo modelo de plantas terrestres, a hepática (Marchantia polymorpha).Como no caso de Arabidopsis, as mudas de tabaco SR-1 cultivadas en medio que contén 25 μM de KAND 11 produciron raíces máis curtas (Fig. 5a).Ademais, 40 de 48 sementes xerminaron en placas que conteñen 200 μM de KAND 11, mentres que as 48 sementes xerminaron en medios tratados con simulacro, o que indica que as concentracións máis altas de KAND foron significativas (p.< 0,05;proba de chi -cadrado) inhibiu a xerminación do tabaco.(Fig. 5b).Ademais, a concentración de KAND 11 que inhibiu o crecemento bacteriano na hepática foi similar á concentración efectiva en Arabidopsis (Fig. 5c).Estes resultados indican que KAND 11 pode inhibir o crecemento dunha variedade de plantas.Despois investigamos a posible citotoxicidade de compostos relacionados coa monoamida dos osos noutros organismos, a saber, as células HeLa humanas e a cepa DH5α de Escherichia coli, como representantes de células animais e bacterianas superiores, respectivamente.Nunha serie de ensaios de proliferación celular, observamos que a cumamonamida 1, o ácido cumamonamídico 6 e o KAND 11 non afectaban o crecemento das células HeLa ou de E. coli en concentracións de 100 μM (Fig. 5d, e).
Inhibición do crecemento de KAND 11 en organismos non-Arabidopsis.( a ) Cultiváronse mudas de tabaco SR-1 de tipo salvaxe de dúas semanas en placas MS situadas verticalmente que conteñen 25 μM de KAND 11. (b) Cultiváronse mudas de tabaco SR-1 de tipo salvaxe de dúas semanas en posición horizontal. Placas MS que conteñen 200 μM de KAND 11. (c) Brotes de hepática Tak-1 de tipo salvaxe de dúas semanas de idade cultivados en placas Gamborg B5 coas concentracións indicadas de KAND 11. As frechas vermellas indican esporas que deixaron de crecer durante as dúas semanas de incubación. período.(d) Ensaio de proliferación celular de células HeLa.O número de células viables foi medido a intervalos de tempo fixos usando un kit de reconto de células 8 (Dojindo).Como control, as células HeLa foron tratadas con 5 μg/ml de actinomicina D (Act D), que inhibe a transcrición da ARN polimerase e causa a morte celular.Realizáronse análises por triplicado.(e) Ensaio de proliferación celular de E. coli.Analizouse o crecemento de E. coli medindo a DO600.Como control, as células foron tratadas con 50 μg/ml de ampicilina (Amp), que inhibe a síntese da parede celular bacteriana.Realizáronse análises por triplicado.
Para descifrar o mecanismo de acción da citotoxicidade causada por compostos relacionados coa uramida, reanalizamos derivados do ácido urbénico con efectos inhibidores moderados.como se mostra na imaxe.Como se mostra nas figuras 2b, 6a, as mudas cultivadas en placas de ágar que conteñen altas concentracións (200 μM) de ácido urmotónico 6 produciron raíces máis curtas e curvadas á esquerda (θ = – 23,7 ± 6,1), mentres que das mudas cultivadas no medio de control, o as mudas produciron raíces case rectas (θ = – 3,8 ± 7,1).Sábese que este crecemento oblicuo característico é o resultado da disfunción dos microtúbulos corticais14,18.En consonancia con este achado, os fármacos desestabilizadores de microtúbulos disopiramida e orizalina inducían unha inclinación da raíz similar nas nosas condicións de crecemento (Figs. 2b, 6a).Ao mesmo tempo, probamos derivados do ácido urmotónico e seleccionamos varios deles que, en determinadas concentracións, inducían o crecemento da raíz oblicua.Os compostos 8, 9 e 15 cambiaron a dirección do crecemento da raíz a 75 μM, 50 μM e 40 μM, respectivamente, o que indica que estes compostos poden desestabilizar eficazmente os microtúbulos (Fig. 2b, 6a).Tamén probamos o derivado do ácido ursólico máis potente, KAND 11, nunha concentración máis baixa (15 µM) e descubrimos que a aplicación de KAND 11 inhibe o crecemento das raíces e que a dirección do crecemento das raíces era desigual, aínda que tendían a inclinarse cara á esquerda ( Figura C3)..Dado que as concentracións máis altas de fármacos desestabilizadores de microtúbulos ás veces inhiben o crecemento das plantas en lugar de causar a inclinación da raíz, posteriormente avaliamos a posibilidade de que KAND 11 afectase aos microtúbulos observando os microtúbulos corticais nas células epidérmicas da raíz.A inmunohistoquímica utilizando anticorpos anti-β-tubulina en células epidérmicas de raíces de plántulas tratadas con 25 μM KAND 11 mostrou a desaparición de case todos os microtúbulos corticais nas células epidérmicas da zona de alongamento (Fig. 6b).Estes resultados indican que o ácido kumamotónico e os seus derivados actúan directa ou indirectamente sobre os microtúbulos para interrompelos e que estes compostos son novos inhibidores de microtúbulos.
O ácido ursónico e os seus derivados alteran os microtúbulos corticais en Arabidopsis thaliana.(a) Ángulo de inclinación da raíz medido en presenza de varios derivados do ácido urmotónico nas concentracións indicadas.Tamén se analizaron os efectos de dous compostos que se sabe que inhiben os microtúbulos: a disopiramida e a orizalina.O recuadro mostra o estándar usado para medir o ángulo de crecemento da raíz.Os asteriscos indican diferenzas significativas co tratamento simulado (proba t, p< 0,05).n>19. Barra de escala = 1 cm.(b) Microtúbulos corticais en células epidérmicas na zona de elongación.Os microtúbulos en raíces de Arabidopsis Col de tipo salvaxe cultivados en placas MS con ou sen 25 μM KAND 11 visualizáronse mediante tinción inmunohistoquímica utilizando anticorpos primarios de β-tubulina e anticorpos secundarios conxugados con Alexa Fluor.Barra de escala = 10 µm.(c) Estrutura mitótica dos microtúbulos no meristema da raíz.Os microtúbulos foron visualizados mediante tinción inmunohistoquímica.As estruturas mitóticas, incluíndo zonas profase, fusos e fragmoplastos, foron contadas a partir de imaxes confocais.As frechas indican estruturas de microtúbulos mitóticos.Os asteriscos indican diferenzas significativas co tratamento simulado (proba t, p< 0,05).n>9. Barra de escala = 50 µm.
Aínda que Ursa ten a capacidade de perturbar a función dos microtúbulos, espérase que o seu mecanismo de acción sexa diferente dos típicos axentes despolimerizadores de microtúbulos.Por exemplo, concentracións máis altas de axentes despolimerizantes de microtúbulos como a disopiramida e a orizalina inducen a expansión anisotrópica das células epidérmicas, mentres que KAND 11 non.Ademais, a co-aplicación de KAND 11 e disopiramida deu lugar a unha resposta combinada de crecemento da raíz inducida por disopiramida e observouse a inhibición do crecemento inducida por KAND 11 (Fig. S4).Tamén analizamos a resposta do mutante hipersensible disopiramida 1-1 (phs1-1) a KAND 11. phs1-1 ten unha mutación puntual da tubulina quinase non canónica e produce raíces máis curtas cando se trata con disopiramida9,20.As mudas mutantes phs1-1 cultivadas en medio de agar que contén KAND 11 tiñan raíces máis curtas semellantes ás cultivadas en disopyramid (fig. S5).
Ademais, observamos estruturas de microtúbulos mitóticos, como zonas de profase, fusos e fragmoplastos, no meristema raíz das mudas tratadas con KAND 11. En consonancia coas observacións para CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, unha diminución significativa de observouse o número de microtúbulos mitóticos (Fig. .6c).
Para caracterizar a citotoxicidade de KAND 11 na resolución subcelular, tratamos células de suspensión BY-2 de tabaco con KAND 11 e observamos a súa resposta.Engadimos primeiro KAND 11 ás células BY-2 que expresan TagRFP-TUA6, que marca fluorescente os microtúbulos, para avaliar o efecto de KAND 11 nos microtúbulos corticais.A densidade dos microtúbulos corticais avaliouse mediante a análise de imaxes, que cuantificou a porcentaxe de píxeles do citoesqueleto entre os píxeles do citoplasma.Os resultados do ensaio mostraron que despois do tratamento con 50 μM ou 100 μM KAND 11 durante 1 hora, a densidade diminuíu significativamente ata 0,94 ± 0,74% ou 0,23 ± 0,28%, respectivamente, mentres que a densidade das células tratadas con DMSO ascendeu a ± 10361. % (Fig. 7a).Estes resultados son consistentes coa observación en Arabidopsis de que o tratamento con KAND 11 induce a despolimerización dos microtúbulos corticais (Fig. 6b).Tamén examinamos a liña BY-2 con filamentos de actina marcados con GFP-ABD despois do tratamento coa mesma concentración de KAND 11 e observamos que o tratamento con KAND 11 interrompía os filamentos de actina.O tratamento con 50 μM ou 100 μM KAND 11 durante 1 h reduciu significativamente a densidade do filamento de actina a 1,20 ± 0,62% ou 0,61 ± 0,26%, respectivamente, mentres que a densidade nas células tratadas con DMSO foi de 1,69% ± 0,69% (Fig.7b).Estes resultados contrastan cos efectos da propizamida, que non afecta os filamentos de actina, e da latrunculina B, un despolimerizador de actina que non afecta aos microtúbulos (SI Figura S6).Ademais, o tratamento con cumamonamida 1, ácido cumamonamida 6 ou KAND 11 non afectou aos microtúbulos das células HeLa (SI Figura S7).Así, crese que o mecanismo de acción de KAND 11 é diferente do dos disruptores do citoesqueleto coñecidos.Ademais, a nosa observación microscópica de células BY-2 tratadas con KAND 11 revelou o inicio da morte celular durante o tratamento con KAND 11 e mostrou que a proporción de células mortas tinguidas de azul de Evans non aumentou significativamente despois de 30 minutos de tratamento con KAND 11, mentres que despois de 90 minutos de tratamento con 50 μM ou 100 μM KAND, o número de células mortas aumentou a 43,7% ou 80,1%, respectivamente (Fig. 7c).En conxunto, estes datos indican que o novo derivado do ácido ursólico KAND 11 é un inhibidor do citoesqueleto específico da planta cun mecanismo de acción previamente descoñecido.
KAND afecta aos microtúbulos corticais, aos filamentos de actina e á viabilidade das células BY-2 do tabaco.( a ) Visualización de microtúbulos corticais en células BY-2 en presenza de TagRFP-TUA6.As células BY-2 tratadas con KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO examináronse mediante microscopía confocal.A densidade dos microtúbulos corticais calculouse a partir de micrografías de 25 células independentes.As letras indican diferenzas significativas (Tukey HSD test, p< 0,05).Barra de escala = 10 µm.( b ) Filamentos de actina cortical en células BY-2 visualizados en presenza de GFP-ABD2.As células BY-2 tratadas con KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO examináronse mediante microscopía confocal.A densidade dos filamentos de actina cortical calculouse a partir de micrografías de 25 células independentes.As letras indican diferenzas significativas (Tukey HSD test, p< 0,05).Barra de escala = 10 µm.(c) Observación de células BY-2 mortas mediante tinción azul de Evans.As células BY-2 tratadas con KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO examináronse mediante microscopía de campo claro.n=3.Barra de escala = 100 µm.
O descubrimento e a aplicación de novos produtos naturais levou a avances significativos en diversos aspectos da vida humana, incluíndo a medicina e a agricultura.Realizáronse investigacións históricas para obter compostos útiles a partir de recursos naturais.En particular, sábese que os actinomicetos son útiles como antibióticos antiparasitarios para os nematodos debido á súa capacidade para producir varios metabolitos secundarios como a avermectina, o composto principal da ivermectina e a bleomicina e os seus derivados, utilizados medicinalmente como axente anticanceríxeno21,22.Así mesmo, a partir de actinomicetos descubriuse unha variedade de compostos herbicidas, algúns dos cales xa se utilizan comercialmente1,23.Polo tanto, a análise de metabolitos de actinomicetos para illar produtos naturais con actividades biolóxicas desexadas considérase unha estratexia eficaz.Neste estudo, descubrimos un novo composto, a cumamonamida, de S. werraensis e sintetizámolo con éxito.O ácido ursónico é un intermediario sintético da urbenamida e os seus derivados.Pode provocar un encrespamento característico da raíz, presentar unha actividade herbicida de moderada a forte e danar directa ou indirectamente os microtúbulos das plantas.Porén, o mecanismo de acción do ácido urmotónico pode diferir do dos inhibidores de microtúbulos existentes, xa que KAND 11 tamén interrompe os filamentos de actina e causa a morte celular, o que suxire un mecanismo regulador polo cal o ácido urmotónico e os seus derivados inflúen nunha ampla gama de estruturas do citoesqueleto..
Unha caracterización máis detallada do ácido urbenónico axudará a comprender mellor o mecanismo de acción do ácido urbenónico.En particular, o seguinte obxectivo é avaliar a capacidade do ácido ursónico para unirse a microtúbulos reducidos para determinar se o ácido ursónico e os seus derivados actúan directamente sobre os microtúbulos e os despolimerizan, ou se a súa acción dá lugar á desestabilización dos microtúbulos.Ademais, no caso de que os microtúbulos non sexan un obxectivo directo, identificar o lugar de acción e os obxectivos moleculares do ácido ursónico nas células vexetais axudará a comprender máis as propiedades dos compostos relacionados e as posibles formas de mellorar a actividade herbicida.O noso ensaio de bioactividade revelou a capacidade citotóxica única do ácido ursónico no crecemento de plantas como Arabidopsis thaliana, tabaco e hepática, mentres que nin E. coli nin células HeLa se viron afectadas.A pouca ou ningunha toxicidade para as células animais é unha vantaxe dos derivados do ácido ursónico se se desenvolven como herbicidas para o seu uso en campos agrícolas abertos.De feito, dado que os microtúbulos son estruturas comúns nos eucariotas, a súa inhibición selectiva nas plantas é un requisito fundamental para os herbicidas.Por exemplo, a propizamida, un axente despolimerizador de microtúbulos que se une directamente á tubulina e inhibe a polimerización, úsase como herbicida debido á súa baixa toxicidade para as células animais24.En contraste coa disopiramida, as benzamidas relacionadas teñen diferentes especificidades diana.Ademais dos microtúbulos vexetais, a RH-4032 ou a benzoxamida tamén inhiben os microtúbulos de células animais ou oomicetos, respectivamente, e a zalilamida úsase como funxicida pola súa baixa fitotoxicidade25,26,27.O oso recén descuberto e os seus derivados presentan citotoxicidade selectiva contra as plantas, pero cómpre sinalar que outras modificacións poden alterar a súa especificidade diana, proporcionando potencialmente derivados adicionais para o control de fungos patóxenos ou oomicetos.
As propiedades únicas do ácido urbenónico e os seus derivados son útiles para o seu desenvolvemento como herbicidas e para o seu uso como ferramentas de investigación.A importancia do citoesqueleto no control da forma das células vexetais é amplamente recoñecida.Estudos anteriores demostraron que as plantas desenvolveron mecanismos complexos de organización dos microtúbulos corticais controlando a dinámica dos microtúbulos para controlar adecuadamente a morfoxénese.Identificáronse un gran número de moléculas responsables da regulación da actividade dos microtúbulos e aínda está en curso investigacións relacionadas3,4,28.A nosa comprensión actual da dinámica dos microtúbulos nas células vexetais non explica completamente os mecanismos de organización dos microtúbulos corticais.Por exemplo, aínda que tanto a disopiramida como a orizalina poden despolimerizar os microtúbulos, a disopiramida causa unha grave distorsión das raíces mentres que a orizalina ten un efecto relativamente leve.Ademais, as mutacións na tubulina, que estabiliza os microtúbulos, tamén provocan a dextrorotación nas raíces, mentres que o paclitaxel, que tamén estabiliza a dinámica dos microtúbulos, non o fai.Polo tanto, estudar e identificar as dianas moleculares do ácido ursólico debería proporcionar novos coñecementos sobre a regulación dos microtúbulos corticais das plantas.Así mesmo, as futuras comparacións de produtos químicos que son eficaces para promover o crecemento distorsionado, como a disopiramida, e de produtos químicos menos eficaces, como a orizalina ou o ácido kumamotor, proporcionarán pistas sobre como se produce o crecemento distorsionado.
Por outra banda, os reordenamentos citoesqueléticos relacionados coa defensa son outra posibilidade para explicar a citotoxicidade do ácido ursónico.A infección dun patóxeno ou a introdución dun elicitor nas células vexetais provoca ás veces a destrución do citoesqueleto e a posterior morte celular29.Por exemplo, informouse que a criptoxantina derivada de oomicetos interrompe os microtúbulos e os filamentos de actina antes da morte das células do tabaco, de xeito similar ao que ocorre co tratamento con KAND30,31.As semellanzas entre as respostas de defensa e as respostas celulares inducidas polo ácido ursónico levaron a hipótese de que desencadean procesos celulares comúns, aínda que é evidente un efecto máis rápido e máis forte do ácido ursónico que a criptoxantina.Non obstante, os estudos demostraron que a ruptura dos filamentos de actina promove a morte celular espontánea, que non sempre vai acompañada da ruptura dos microtúbulos29.Ademais, está por ver se o patóxeno ou o elicitor causan un crecemento distorsionado das raíces, como fan os derivados do ácido ursónico.Así, o coñecemento molecular que vincula as respostas de defensa e o citoesqueleto é un problema atractivo a tratar.Ao explotar a presenza de compostos de baixo peso molecular relacionados co ácido ursónico, así como unha serie de derivados con potencias variables, poden proporcionar oportunidades para dirixirse a mecanismos celulares descoñecidos.
En conxunto, o descubrimento e a aplicación de novos compostos que modulan a dinámica dos microtúbulos proporcionarán métodos poderosos para abordar os complexos mecanismos moleculares subxacentes á determinación da forma das células vexetais.Neste contexto, o ácido urmotónico composto recentemente desenvolvido, que afecta aos microtúbulos e filamentos de actina e induce a morte celular, pode proporcionar unha oportunidade para descifrar a conexión entre o control dos microtúbulos e estes outros mecanismos.Así, a análise química e biolóxica mediante ácido urbenónico axudaranos a comprender os mecanismos reguladores moleculares que controlan o citoesqueleto da planta.
Inocular S. werraensis MK493-CF1 nun matraz Erlenmeyer de 500 mL que contén 110 mL de medio de semente composto por 2% (p/v) de galactosa, 2% (p/v) de pasta de esencia, 1% (p/v) Composición de Bacto .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (p/v) de extracto de millo (KOGOSTCH Co., Ltd., Xapón), 0,2 % (p/v) (NH4)2SO4 e 0,2 % de CaCO3 en auga desionizada.(pH 7,4 antes da esterilización).Os cultivos de sementes incubáronse nun agitador rotativo (180 rpm) a 27 °C durante 2 días.Cultivo de produción mediante fermentación en estado sólido.O cultivo de sementes (7 ml) foi transferido a un matraz K-1 de 500 ml que contiña 40 g de medio de produción composto por 15 g de cebada prensada (MUSO Co., Ltd., Xapón) e 25 g de auga desionizada (pH non axustado). antes da esterilización).).A fermentación levouse a cabo a 30 °C na escuridade durante 14 días.O material de fermentación extraeuse con 40 ml/botella de EtOH e centrifugado (1500 g, 4 ° C, 10 min).O sobrenadante do cultivo (60 ml) extraeuse cunha mestura de MeOH/EtOAc ao 10%.A capa orgánica evaporouse a presión reducida para obter un residuo (59,5 mg), que foi sometido a HPLC con elución en gradiente (0-10 minutos: 90 %) nunha columna de fase inversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID). 10 mm × lonxitude 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutos: 90% H2O/CH3CN a 70% H2O/CH3CN (gradiente), 35–45 minutos: 90% H2O/EtOH, 45–155 minutos: 90% H2O /EtOH a 100% EtOH (gradiente (gradiente), 155-200 min: 100% EtOH) a un caudal de 1,5 ml/min, a cumamonamida (1, 36,0 mg) illouse como un po amorfo branco.
Kumamotoamida (1);1H-RMN (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-RMN (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valor calculado: 141,0659, valor medido: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm
As sementes de Columbia (Col-0) obtivéronse do Centro de Recursos Biolóxicos de Arabidopsis (ABRC) con permiso para o seu uso na investigación.As sementes Col-0 propagáronse e mantivéronse nas condicións do noso laboratorio e utilizáronse como plantas de Arabidopsis de tipo salvaxe.As sementes de Arabidopsis foron esterilizadas en superficie e cultivadas en medio Murashige e Skoog de media resistencia que contén 2% de sacarosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (p/v) de ácido 2-(4-morfolino)etanosulfónico (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ).) e ágar ao 1,5% (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, a 23 °C e luz constante.As sementes do mutante phs1-1 foron proporcionadas por T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
As sementes da cepa SR-1 foron proporcionadas por T. Hashimoto (Instituto de Ciencia e Tecnoloxía de Nara) e utilizáronse como plantas de tabaco de tipo salvaxe.As sementes de tabaco foron esterilizadas na superficie e empapadas en auga estéril durante tres noites para favorecer a xerminación, despois colocáronse nunha solución de media concentración que contén 2% de sacarosa, 0,05% (p/v) de MES e 0,8% de goma gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.e medio Skoog) con pH 5,7 e incubado a 23°C baixo luz constante.
A cepa Tak-1 foi proporcionada por T. Kohchi (Universidade de Kioto) e utilizouse como unidade experimental estándar para o estudo da hepática.Gemma obtívose a partir de plantas cultivadas esterilizadas e despois colouse en medio Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) que contén 1% de sacarosa e 0,3% de goma gellan e incubouse a 23 °C baixo luz continua.
As células BY-2 de tabaco (Nicotiana tabacum L. cv. Amarelo brillante 2) foron proporcionadas por S. Hasezawa (Universidade de Tokio).As células BY-2 diluíronse 95 veces en medio Linsmeier e Skoog modificado e complementáronse semanalmente con ácido 2,4-diclorofenoxiacético 32 .A suspensión celular mesturouse nun agitador rotativo a 130 rpm a 27 °C na escuridade.Lavar as células con 10 veces o volume do medio fresco e resuspender no mesmo medio.As liñas celulares transxénicas BY-2 que expresan de forma estable o marcador de microtúbulos TagRFP-TUA6 ou o marcador de filamentos de actina GFP-ABD2 baixo o promotor 35S do virus do mosaico da coliflor foron xeradas como se describe33,34,35.Estas liñas celulares pódense manter e sincronizar mediante procedementos similares aos utilizados para a liña celular orixinal BY-2.
As células HeLa cultiváronse en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) complementado con suero bovino fetal ao 10%, penicilina 1,2 U/ml e estreptomicina 1,2 μg/ml nunha incubadora a 37 °C cun 5% de CO2.
Todos os experimentos descritos neste manuscrito realizáronse de acordo coas normas e directrices de bioseguridade xaponesas.
Os compostos disolvéronse en dimetilsulfóxido (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) como solucións stock e diluíronse en medio MS para Arabidopsis e tabaco ou medio Gamborg B5 para hepática.Para o ensaio de inhibición do crecemento das raíces, sementáronse máis de 10 sementes por placa en medio de agar que contiña os compostos indicados ou DMSO.As sementes incubáronse nunha cámara de crecemento durante 7 días.Fotografáronse as mudas e mediuse a lonxitude das raíces.Para o ensaio de xerminación de Arabidopsis, sementáronse 48 sementes por placa en medio de agar que contiña composto 200 μM ou DMSO.As sementes de Arabidopsis cultiváronse nunha cámara de crecemento e contou o número de mudas xerminadas 7 días despois da xerminación (dag).Para o ensaio de xerminación do tabaco, sementáronse 24 sementes por placa en medio de agar que contiña 200 μM de KAND ou DMSO.As sementes de tabaco cultiváronse nunha cámara de crecemento e o número de mudas xerminadas foi contado despois de 14 días.Para o ensaio de inhibición do crecemento da hepática, 9 embrións de cada placa colocáronse en medio de agar que contiña as concentracións indicadas de KAND ou DMSO e incubáronse nunha cámara de crecemento durante 14 días.
Use mudas tinguidas con 5 mg/ml de ioduro de propidio (PI) para visualizar a organización do meristemo radicular.Os sinais de PI foron observados mediante microscopía de fluorescencia utilizando un microscopio de varrido láser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
A tinción histoquímica das raíces con β-glucuronidasa (GUS) realizouse segundo o protocolo descrito por Malami e Benfey36.As plántulas fixáronse en acetona ao 90% durante a noite, tinguironse con 0,5 mg/ml de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-glucurónico en tampón GUS durante 1 hora e colocáronse nunha solución de cloraldehido hidratado.(8 g de hidrato de cloral, 2 ml de auga e 1 ml de glicerol) e observado mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial utilizando un microscopio Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Os ángulos das raíces midéronse en mudas de 7 días cultivadas en placas colocadas verticalmente.Mida o ángulo da raíz desde a dirección do vector da gravidade como se describe no paso 6.
Observouse a disposición dos microtúbulos corticais tal e como se describe, con pequenas modificacións no protocolo 37 .Anticorpo anti-β-tubulina (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) e IgG anti-rato conxugado con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) foron utilizados como anticorpos primarios e secundarios en dilucións 1:1000 e 1:100, respectivamente.As imaxes de fluorescencia foron adquiridas mediante un microscopio de varrido láser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).Adquira imaxes Z-stack e crea proxeccións de máxima intensidade segundo as instrucións do fabricante.
O ensaio de proliferación celular HeLa realizouse usando o Kit de conteo de células 8 (Dojindo) segundo as instrucións do fabricante.
O crecemento de E. coli DH5α analizouse medindo a densidade celular en cultivo mediante un espectrofotómetro a 600 nm (DO600).
A organización do citoesqueleto en células transxénicas BY-2 observouse mediante un microscopio de fluorescencia equipado cun dispositivo de exploración confocal CSU-X1 (Yokogawa) e unha cámara sCMOS (Zyla, Andor Technology).A densidade citoesquelética foi avaliada mediante a análise de imaxes, que cuantificou a porcentaxe de píxeles citoesqueléticos entre os píxeles citoplasmáticos en imaxes confocais usando o software ImageJ como se describe38,39.
Para detectar a morte celular nas células BY-2, unha alícuota da suspensión celular foi incubada con azul de Evans ao 0,05% durante 10 minutos a temperatura ambiente.A tinción selectiva de azul de Evans das células mortas depende da extrusión do colorante das células viables pola membrana plasmática intacta40.As células tinguidas foron observadas mediante un microscopio de campo brillante (BX53, Olympus).
As células HeLa cultiváronse en DMEM complementado cun 10% de FBS nunha incubadora humidificada a 37 °C e 5% de CO2.As células foron tratadas con 100 μM de KAND 11, ácido kumamonámico 6, kumamonamida 1, 100 ng/ml de colcemid (Gibco) ou 100 ng/ml de Nocodmaze (Sigma) durante 6 h a 37 °C.As células fixéronse con MetOH durante 10 min e despois con acetato durante 5 min a temperatura ambiente.As células fixas incubáronse con anticorpo primario β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluído en BSA/PBS ao 0,5% durante 2 horas, laváronse 3 veces con TBST e, a continuación, incubáronse con anticorpo de cabra Alexa Fluor.488 1 hora.– IgG de rato (Thermo Fisher Scientific: A11001) e 15 ng/ml de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluídos en BSA/PBS ao 0,5%.Despois de lavar con TBST tres veces, observáronse células tinguidas nun microscopio invertido Nikon Eclipse Ti-E.As imaxes foron capturadas cunha cámara CCD Hamamatsu ORCA-R2 arrefriada usando o software MetaMorph (Dispositivos Moleculares).
Hora de publicación: 17-Xun-2024