Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter mellores resultados, recomendámosche que uses unha versión máis recente do teu navegador (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, mostramos o sitio sen estilos nin JavaScript.
O descubrimento e o uso beneficioso de produtos naturais poden axudar a mellorar a vida humana. Os produtos químicos inhibidores do crecemento das plantas úsanse amplamente como herbicidas para controlar as malas herbas. Debido á necesidade de usar diferentes tipos de herbicidas, existe a necesidade de identificar compostos con novos mecanismos de acción. Neste estudo, descubrimos un novo composto N-alcoxipirrol, a cumamonamida, de Streptomyces werraensis MK493-CF1 e establecemos o proceso de síntese completo. Mediante ensaios de actividade biolóxica, descubrimos que o ácido urs-monoámico é un intermediario sintético da urs-monoamida e un potencial...inhibidor do crecemento das plantasAdemais, desenvolvemos varios derivados do ácido urbenónico, incluído o derivado urbeniloxi (UDA), que ten unha alta actividade herbicida sen afectar negativamente o crecemento das células HeLa. Tamén descubrimos que os derivados do ácido urmotónico alteran os microtúbulos das plantas; ademais, o KAND afecta os filamentos de actina e induce a morte celular; estes efectos multifacéticos difiren dos dos inhibidores de microtúbulos coñecidos e suxiren un novo mecanismo de acción para o ácido ursónico, o que representa unha vantaxe importante no desenvolvemento de novos herbicidas.
O descubrimento e a aplicación práctica de produtos naturais beneficiosos e os seus derivados é un medio para mellorar a calidade de vida humana. Os metabolitos secundarios producidos por microorganismos, plantas e insectos levaron a grandes avances na medicina e na agricultura. Moitos antibióticos e fármacos antileucémicos foron desenvolvidos a partir de produtos naturais. Ademais, varios tipos depesticidas, extráense funxicidas e herbicidas destes produtos naturais para o seu uso na agricultura. En particular, os herbicidas para o control de herbas daniñas son ferramentas importantes para aumentar o rendemento das colleitas na agricultura moderna, e xa se usan comercialmente varios tipos de compostos. Varios procesos celulares nas plantas, como a fotosíntese, o metabolismo dos aminoácidos, a síntese da parede celular, a regulación da mitose, a sinalización de fitohormonas ou a síntese de proteínas, considéranse obxectivos típicos dos herbicidas. Os compostos que inhiben a función dos microtúbulos son unha clase común de herbicidas que afectan o crecemento das plantas ao afectar a regulación mitótica2.
Os microtúbulos son compoñentes do citoesqueleto e están amplamente conservados nas células eucariotas. O heterodímero de tubulina consiste en α-tubulina e β-tubulina que forman protofilamentos lineares de microtúbulos, con 13 protofilamentos que forman unha estrutura cilíndrica. Os microtúbulos desempeñan múltiples funcións nas células vexetais, incluíndo a determinación da forma celular, a división celular e o transporte intracelular3,4. As células vexetais conteñen microtúbulos debaixo da membrana plasmática en interfase, e crese que estes chamados microtúbulos corticais controlan a organización das microfibrilas de celulosa mediante a regulación dos complexos de celulosa sintase4,5. Os microtúbulos corticais das células epidérmicas da raíz, presentes na zona de alongamento rápido da punta da raíz, están situados lateralmente, e as microfibras de celulosa seguen estes microtúbulos e limitan a dirección da expansión celular, promovendo así o alongamento celular anisotrópico. Polo tanto, a función dos microtúbulos está estreitamente relacionada coa morfoloxía da planta. As substitucións de aminoácidos nos xenes que codifican a tubulina causan unha distorsión das disposicións dos microtúbulos corticais e un crecemento cara á esquerda ou á dereita en *Arabidopsis* 6,7. Do mesmo xeito, as mutacións nas proteínas asociadas aos microtúbulos que regulan a dinámica dos microtúbulos tamén poden levar a un crecemento distorsionado das raíces8,9,10,11,12,13. Ademais, o tratamento con herbicidas que alteran os microtúbulos, como a disopiramida, tamén coñecida como pretilaclor, tamén causa un crecemento oblicuo da raíz cara á esquerda14. Estes datos indican que a regulación precisa da función dos microtúbulos é fundamental para determinar a dirección do crecemento das plantas.
Descubríronse varios tipos de inhibidores dos microtúbulos e estes fármacos fixeron contribucións significativas á investigación do citoesqueleto, así como á agricultura e á medicina2. En particular, a orizalina, os compostos de dinitroanilina, a disopiramida, os compostos relacionados coa benzamida e os seus análogos poden inhibir a función dos microtúbulos e, polo tanto, inhibir o crecemento das plantas. Polo tanto, úsanse amplamente como herbicidas. Non obstante, dado que os microtúbulos son un compoñente importante das células vexetais e animais, a maioría dos inhibidores dos microtúbulos son citotóxicos para ambos os tipos de células. Polo tanto, a pesar da súa recoñecida utilidade como herbicidas, utilízase un número limitado de axentes antimicrotúbulos con fins prácticos.
Streptomyces é un xénero da familia Streptomyces, que inclúe bacterias filamentosas aeróbicas, grampositivas e amplamente coñecidas pola súa capacidade para producir unha ampla gama de metabolitos secundarios. Polo tanto, considérase unha das fontes máis importantes de novos produtos naturais bioloxicamente activos. No presente estudo, descubrimos un novo composto chamado cumamonamida, que foi illado de Streptomyces werraensis MK493-CF1 e S. werraensis ISP 5486. Mediante análise espectral e análise espectral completa, caracterizouse a estrutura da cumamonamida e determinouse o seu esqueleto único de N-alcoxipirrol. síntese. Descubriuse que o ácido ursmónico, un intermediario sintético da ursmonoamida e os seus derivados, inhibe o crecemento e a xerminación da popular planta modelo Arabidopsis thaliana. Nun estudo da relación estrutura-actividade, descubrimos que un composto con C9 modificado a ácido ursónico, chamado derivado noniloxi do ácido ursónico (KAND), mellora significativamente o efecto inhibitorio sobre o crecemento e a xerminación. Cabe destacar que o inhibidor do crecemento das plantas recentemente descuberto tamén afectou o crecemento do tabaco e das hepáticas e non foi citotóxico para as bacterias nin para as células HeLa. Ademais, algúns derivados do ácido urmotónico inducen un fenotipo radicular distorsionado, o que implica que estes derivados afectan directa ou indirectamente aos microtúbulos. En consonancia con esta idea, as nosas observacións de microtúbulos marcados inmunohistoquimicamente ou con proteínas fluorescentes indican que o tratamento con KAND despolimeriza os microtúbulos. Ademais, o tratamento con derivados do ácido kumamotonico interrompeu os microfilamentos de actina. Así, descubrimos un novo inhibidor do crecemento das plantas cuxo mecanismo de acción único implica a destrución do citoesqueleto.
A cepa MK493-CF1 foi illada do solo en Shinagawa-ku, Toquio. A cepa MK493-CF1 formou un micelio estromal ben ramificado. Determinouse a secuencia parcial do xene do ARN ribosómico 16S (1422 pb). Esta cepa é moi similar a S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pb, T: cepa típica, 99,93%). Baseándose neste resultado, determinouse que esta cepa estaba estreitamente relacionada coa cepa tipo de S. werraensis. Polo tanto, denominamos provisionalmente esta cepa S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T tamén produce os mesmos compostos bioactivos. Dado que houbo poucas investigacións iniciais sobre a obtención de produtos naturais deste microorganismo, levouse a cabo máis investigacións químicas. Tras o cultivo de S. werraensis MK493-CF1 en medio de cebada mediante fermentación en estado sólido a 30 °C durante 14 días, o medio extraeuse con EtOH ao 50 %. Secáronse 60 ml da mostra para obter 59,5 mg de extracto bruto. O extracto bruto someteuse a HPLC de fase inversa para obter N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida (1, denominada cumamonamida, 36,0 mg). A cantidade total de 1 é aproximadamente o 60 % do extracto bruto. Polo tanto, decidimos estudar en detalle as propiedades da kumamotoamida 1.
A cumamonamida 1 é un po amorfo branco e a espectrometría de masas de alta resolución (HRESIMS) confirma o C6H8N2O2 (Fig. 1). O fragmento de pirrol substituído con C2 deste composto caracterízase por δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH no espectro de RMN 1H: 4,5 Hz, H-5) e δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), e o espectro de RMN 13C mostra a presenza de catro átomos de carbono sp2. A presenza dun grupo amida na posición C2 avaliouse mediante correlación HMBC desde o protón C-3 ao carbono carbonilo da amida a δC 161,1. Ademais, os picos de RMN de 1H e 13C a δH 4,10 (3H, S) e δC 68,3 indican a presenza de grupos N-metoxi na molécula. Aínda que a posición correcta do grupo metoxi aínda non se determinara mediante análises espectroscópicas como a espectroscopia de diferenzas melloradas e a abreviatura nuclear de Overhauser (NOEDF), a N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida converteuse no primeiro composto candidato.
Para determinar a estrutura correcta de 1, realizouse unha síntese total (Fig. 2a). O tratamento da 2-aminopiridina 2 dispoñible comercialmente con m-CPBA deu como resultado o N-óxido 3 correspondente cun rendemento cuantitativo. Despois da 2-aminoazidación de 2, levouse a cabo a reacción de ciclocondensación descrita por Abramovich en benceno a 90 °C para obter o 1-hidroxi-1H-pirrol-2-carbonitrilo 5 desexado en gramos. Velocidade 60 % (dúas etapas). 15,16. A metilación e hidrólise de 4 deron entón ácido 1-metoxi-1H-pirrol-2-carboxílico (denominado "ácido cumotónico", 6) cun bo rendemento (70 %, dúas etapas). Finalmente, a amidación a través do intermediario de cloruro de ácido 6 usando amoníaco acuoso deu a amida de Kumamoto 1 cun rendemento do 98 %. Todos os datos espectrais do 1 sintetizado foron similares ao 1 illado, polo que se determinou a estrutura de 1;
Síntese xeral e análise da actividade biolóxica da urbenamida e do ácido urbénico. (a) Síntese total de amida de Kumamoto. (b) Cultiváronse plántulas de Arabidopsis Columbia (Col) de tipo silvestre de sete días de idade en placas de Murashige e Skoog (MS) que contiñan cumamonamida 6 ou cumamonamida 1 nas concentracións indicadas. Barra de escala = 1 cm.
Primeiro, avaliamos as actividades biolóxicas da urbenamida e os seus intermediarios pola súa capacidade para modular o crecemento das plantas. Engadimos varias concentracións de ursmonamida 1 ou ácido ursónico 6 a medio de ágar MS e cultivamos mudas de Arabidopsis thaliana neste medio. Estes ensaios mostraron que as altas concentracións (500 μM) de 6 inhibían o crecemento das raíces (Fig. 2b). A continuación, xeramos varios derivados substituíndo a posición N1 de 6 e realizamos estudos de relación estrutura-actividade sobre eles (o proceso de síntese analóxica descríbese na Información complementaria (SI)). As mudas de Arabidopsis cultiváronse nun medio que contiña 50 μM de derivados do ácido ursónico e mediuse a lonxitude da raíz, como se mostra na imaxe. Como se mostra nas Figuras 3a, b e S1, os ácidos cumamo teñen diferentes lonxitudes de cadeas alcoxi lineais (9, 10, 11, 12 e 13) ou cadeas alcoxi grandes (15, 16 e 17) na posición N1. Os derivados mostraron unha inhibición significativa do crecemento das raíces. Ademais, descubrimos que a aplicación de 200 μM de 10, 11 ou 17 inhibía a xerminación (Figs. 3c e S2).
Estudo da relación estrutura-actividade da amida de Kumamoto e compostos relacionados. (a) Estrutura e esquema de síntese de análogos. (b) Cuantificación da lonxitude da raíz de plántulas de 7 días de idade cultivadas en medio MS con ou sen derivados de cumamonamida de 50 μM. Os asteriscos indican diferenzas significativas co tratamento simulado (proba t, p< 0,05). n>18. Os datos móstranse como media ± desviación estándar. nt significa "non probado" porque máis do 50 % das sementes non xerminaron. (c) Cuantificación da taxa de xerminación das sementes tratadas incubadas durante 7 días en medio MS con ou sen cumamonamida a 200 μM e compostos relacionados. Os asteriscos indican diferenzas significativas co tratamento simulado (proba de chi ao cadrado). n = 96.
Curiosamente, a adición de cadeas laterais de alquilo máis longas que C9 reduciu a actividade inhibitoria, o que suxire que os compostos relacionados co ácido kumamotoico requiren cadeas laterais dun certo tamaño para exhibir a súa actividade biolóxica.
Dado que a análise da relación estrutura-actividade mostrou que o C9 estaba modificado a ácido ursónico e que o derivado noniloxi do ácido ursónico (en diante denominado KAND 11) era o inhibidor do crecemento das plantas máis eficaz, realizamos unha caracterización máis detallada do KAND 11. O tratamento de Arabidopsis con 50 μM de KAND 11 impediu case por completo a xerminación, mentres que concentracións máis baixas (40, 30, 20 ou 10 μM) de KAND 11 inhibían o crecemento das raíces dun xeito dependente da dose (Fig. 4a, b). Para comprobar se o KAND 11 afecta a viabilidade do meristema radicular, examinamos os meristemas radiculares tinguidos con ioduro de propidio (PI) e medimos o tamaño da área do meristema. O tamaño do meristemo das plántulas cultivadas nun medio que contiña 25 μM de KAND-11 foi de 151,1 ± 32,5 μm, mentres que o tamaño do meristemo das plántulas cultivadas nun medio de control que contiña DMSO foi de 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d), o que indica que KAND-11 restaura a actividade celular. propagación. Meristemo da raíz. En consonancia con isto, o tratamento con KAND 11 reduciu a cantidade do sinal do marcador de división celular CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS no meristemo da raíz (Fig. 4e) 17. Estes resultados indican que KAND 11 inhibe o crecemento da raíz ao reducir a actividade de proliferación celular.
Análise do efecto inhibitorio dos derivados do ácido urbenónico (derivados urbeniloxi) sobre o crecemento. (a) Mudas de Col de tipo salvaxe de 7 días de idade cultivadas en placas de MS coas concentracións indicadas de KAND 11. Barra de escala = 1 cm. (b) Cuantificación da lonxitude da raíz. As letras indican diferenzas significativas (proba HSD de Tukey, p< 0,05). n>16. Os datos móstranse como media ± desviación estándar. (c) Microscopía confocal de raíces de Col de tipo salvaxe tinguidas con ioduro de propidio cultivadas en placas de MS con ou sen KAND 11 a 25 μM. Os corchetes brancos indican o meristema da raíz. Barra de escala = 100 µm. (d) Cuantificación do tamaño do meristema da raíz (n = 10 a 11). As diferenzas estatísticas determináronse mediante a proba t (p< 0,05). As barras representan o tamaño medio do meristema. (e) Microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) dun meristema raíz que contén a construción CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS tinguida e tinguida en plántulas de 5 días de idade cultivadas en placas de MS con ou sen ensaio KAND de 25 µM.
A fitotoxicidade de KAND 11 probouse adicionalmente empregando outra planta dicotiledónea, o tabaco (Nicotiana tabacum) e un importante organismo modelo de planta terrestre, a hepática (Marchantia polymorpha). Do mesmo xeito que no caso de Arabidopsis, as mudas de tabaco SR-1 cultivadas en medio que contiña 25 μM de KAND 11 produciron raíces máis curtas (Fig. 5a). Ademais, 40 das 48 sementes xerminaron en placas que contiñan 200 μM de KAND 11, mentres que as 48 sementes xerminaron en medios tratados con placebo, o que indica que as concentracións máis altas de KAND foron significativas (p< 0,05; proba de chi ao cadrado) inhibiu a xerminación do tabaco. (Fig. 5b). Ademais, a concentración de KAND 11 que inhibiu o crecemento bacteriano na hepática foi similar á concentración efectiva en Arabidopsis (Fig. 5c). Estes resultados indican que KAND 11 pode inhibir o crecemento dunha variedade de plantas. Despois investigamos a posible citotoxicidade dos compostos relacionados coa monoamida de oso noutros organismos, concretamente células HeLa humanas e a cepa DH5α de Escherichia coli, como representantes de células animais superiores e bacterianas, respectivamente. Nunha serie de ensaios de proliferación celular, observamos que a cumamonamida 1, o ácido cumamonadídico 6 e KAND 11 non afectaron o crecemento de células HeLa ou E. coli a concentracións de 100 μM (Fig. 5d, e).
Inhibición do crecemento de KAND 11 en organismos non *Arabidopsis*. (a) Plántas de tabaco SR-1 de tipo salvaxe de dúas semanas de idade cultiváronse en placas de MS colocadas verticalmente que contiñan 25 μM de KAND 11. (b) Plántas de tabaco SR-1 de tipo salvaxe de dúas semanas de idade cultiváronse en placas de MS colocadas horizontalmente que contiñan 200 μM de KAND 11. (c) Gomas de hepática Tak-1 de tipo salvaxe de dúas semanas de idade cultivadas en placas Gamborg B5 coas concentracións indicadas de KAND 11. As frechas vermellas indican as esporas que deixaron de crecer dentro do período de incubación de dúas semanas. (d) Ensaio de proliferación celular de células HeLa. O número de células viables mediuse a intervalos de tempo fixos usando un kit de reconto celular 8 (Dojindo). Como control, as células HeLa tratáronse con 5 μg/ml de actinomicina D (Act D), que inhibe a transcrición da ARN polimerase e causa a morte celular. As análises realizáronse por triplicado. (e) Ensaio de proliferación celular de *E. coli*. O crecemento de *E. coli* analizouse medindo a DO600. Como control, as células foron tratadas con ampicilina (Amp) a 50 μg/ml, que inhibe a síntese da parede celular bacteriana. As análises realizáronse por triplicado.
Para descifrar o mecanismo de acción da citotoxicidade causada por compostos relacionados coa uramida, reanalizamos derivados do ácido urbénico con efectos inhibitorios moderados, como se mostra na imaxe. Como se mostra nas figuras 2b e 6a, as plántulas cultivadas en placas de ágar que contiñan altas concentracións (200 μM) de ácido urmotónico 6 produciron raíces máis curtas e curvadas á esquerda (θ = – 23,7 ± 6,1), mentres que as plántulas cultivadas no medio de control produciron raíces case rectas (θ = – 3,8 ± 7,1). Sábese que este crecemento oblicuo característico é o resultado da disfunción dos microtúbulos corticais14,18. En consonancia con este achado, os fármacos desestabilizadores dos microtúbulos, a disopiramida e a orizalina, induciron unha inclinación similar das raíces nas nosas condicións de crecemento (figuras 2b e 6a). Ao mesmo tempo, probamos derivados do ácido urmotónico e seleccionamos varios deles que, a certas concentracións, inducían o crecemento oblicuo das raíces. Os compostos 8, 9 e 15 cambiaron a dirección do crecemento das raíces a 75 μM, 50 μM e 40 μM, respectivamente, o que indica que estes compostos poden desestabilizar eficazmente os microtúbulos (Fig. 2b, 6a). Tamén probamos o derivado do ácido ursólico máis potente, KAND 11, a unha concentración máis baixa (15 µM) e descubrimos que a aplicación de KAND 11 inhibía o crecemento das raíces e que a dirección do crecemento das raíces era irregular, aínda que tendían a inclinarse cara á esquerda (Figura C3). Dado que as concentracións máis altas de fármacos desestabilizadores dos microtúbulos ás veces inhiben o crecemento das plantas en lugar de causar a inclinación das raíces, posteriormente avaliamos a posibilidade de que KAND 11 afecte os microtúbulos observando os microtúbulos corticais nas células epidérmicas das raíces. A inmunohistoquímica utilizando anticorpos anti-β-tubulina en células epidérmicas de raíces de plántulas tratadas con 25 μM de KAND 11 mostrou a desaparición de case todos os microtúbulos corticais nas células epidérmicas na zona de elongación (Fig. 6b). Estes resultados indican que o ácido kumamotonico e os seus derivados actúan directa ou indirectamente sobre os microtúbulos para interrompelos e que estes compostos son novos inhibidores dos microtúbulos.
O ácido ursónico e os seus derivados alteran os microtúbulos corticais en *Arabidopsis thaliana*. (a) Ángulo de inclinación da raíz medido en presenza de varios derivados do ácido urmotónico ás concentracións indicadas. Tamén se analizaron os efectos de dous compostos que se sabe que inhiben os microtúbulos: a disopiramida e a orizalina. O cadro mostra o estándar utilizado para medir o ángulo de crecemento da raíz. Os asteriscos indican diferenzas significativas co tratamento simulado (proba t, p< 0,05). n>19. Barra de escala = 1 cm. (b) Microtúbulos corticais en células epidérmicas na zona de elongación. Os microtúbulos en raíces de Arabidopsis Col de tipo salvaxe cultivadas en placas de MS con ou sen KAND 11 de 25 μM visualizáronse mediante tinguidura inmunohistoquímica utilizando anticorpos primarios de β-tubulina e anticorpos secundarios conxugados con Alexa Fluor. Barra de escala = 10 µm. (c) Estrutura mitótica dos microtúbulos no meristema da raíz. Os microtúbulos visualizáronse mediante tinguidura inmunohistoquímica. As estruturas mitóticas, incluíndo zonas de profase, fusos e fragmoplastos, contáronse a partir de imaxes confocais. As frechas indican estruturas de microtúbulos mitóticos. Os asteriscos indican diferenzas significativas co tratamento simulado (proba t, p< 0,05). n>9. Barra de escala = 50 µm.
Aínda que Ursa ten a capacidade de interromper a función dos microtúbulos, espérase que o seu mecanismo de acción sexa diferente do dos axentes despolimerizadores de microtúbulos típicos. Por exemplo, concentracións máis altas de axentes despolimerizadores de microtúbulos como a disopiramida e a orizalina inducen a expansión anisotrópica das células epidérmicas, mentres que KAND 11 non o fai. Ademais, a coaplicación de KAND 11 e disopiramida deu lugar a unha resposta combinada de crecemento radicular inducida por disopiramida e observouse unha inhibición do crecemento inducida por KAND 11 (Fig. S4). Tamén analizamos a resposta do mutante hipersensible disopiramida 1-1 (phs1-1) a KAND 11. phs1-1 ten unha mutación puntual da tubulina quinase non canónica e produce raíces máis curtas cando se trata con disopiramida9,20. As mudas mutantes phs1-1 cultivadas en medio de ágar que contiña KAND 11 tiñan raíces máis curtas similares ás cultivadas en disopiramida (fig. S5).
Ademais, observamos estruturas de microtúbulos mitóticos, como zonas de profase, fusos e fragmoplastos, no meristema da raíz das plántulas tratadas con KAND 11. En consonancia coas observacións para CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, observouse unha diminución significativa no número de microtúbulos mitóticos (Fig. .6c).
Para caracterizar a citotoxicidade de KAND 11 a resolución subcelular, tratamos células en suspensión BY-2 de tabaco con KAND 11 e observamos a súa resposta. Primeiro engadimos KAND 11 a células BY-2 que expresan TagRFP-TUA6, que marca fluorescentemente os microtúbulos, para avaliar o efecto de KAND 11 nos microtúbulos corticais. A densidade de microtúbulos corticais avaliouse mediante análise de imaxes, que cuantificou a porcentaxe de píxeles do citoesqueleto entre os píxeles citoplasmáticos. Os resultados do ensaio mostraron que, despois do tratamento con 50 μM ou 100 μM de KAND 11 durante 1 hora, a densidade diminuíu significativamente ata o 0,94 ± 0,74 % ou o 0,23 ± 0,28 %, respectivamente, mentres que a densidade de células tratadas con DMSO ascendeu a 1,61 ± 0,34 % (Fig. 7a). Estes resultados son consistentes coa observación en Arabidopsis de que o tratamento con KAND 11 induce a despolimerización dos microtúbulos corticais (Fig. 6b). Tamén examinamos a liña BY-2 con filamentos de actina marcados con GFP-ABD despois do tratamento coa mesma concentración de KAND 11 e observamos que o tratamento con KAND 11 interrompía os filamentos de actina. O tratamento con 50 μM ou 100 μM de KAND 11 durante 1 h reduciu significativamente a densidade dos filamentos de actina a 1,20 ± 0,62 % ou 0,61 ± 0,26 %, respectivamente, mentres que a densidade nas células tratadas con DMSO foi de 1,69 ± 0,51 % (Fig. 2). 7b). Estes resultados contrastan cos efectos da propizamida, que non afecta os filamentos de actina, e a latrunculina B, un despolimerizador de actina que non afecta os microtúbulos (Figura S6 da SI). Ademais, o tratamento con cumamonamida 1, ácido cumamonamida 6 ou KAND 11 non afectou os microtúbulos nas células HeLa (Figura S7 da SI). Polo tanto, crese que o mecanismo de acción de KAND 11 é diferente do dos disruptores do citoesqueleto coñecidos. Ademais, a nosa observación microscópica de células BY-2 tratadas con KAND 11 revelou o inicio da morte celular durante o tratamento con KAND 11 e mostrou que a proporción de células mortas tinguidas con azul Evans non aumentou significativamente despois de 30 minutos de tratamento con KAND 11, mentres que despois de 90 minutos de tratamento con KAND 50 μM ou 100 μM, o número de células mortas aumentou ao 43,7 % ou ao 80,1 %, respectivamente (Fig. 7c). En conxunto, estes datos indican que o novo derivado do ácido ursólico KAND 11 é un inhibidor do citoesqueleto específico de plantas cun mecanismo de acción previamente descoñecido.
A KAND afecta os microtúbulos corticais, os filamentos de actina e a viabilidade das células BY-2 do tabaco. (a) Visualización dos microtúbulos corticais en células BY-2 en presenza de TagRFP-TUA6. As células BY-2 tratadas con KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO foron examinadas mediante microscopía confocal. A densidade dos microtúbulos corticais calculouse a partir de micrografías de 25 células independentes. As letras indican diferenzas significativas (proba HSD de Tukey, p< 0,05). Barra de escala = 10 µm. (b) Filamentos de actina corticais en células BY-2 visualizadas en presenza de GFP-ABD2. As células BY-2 tratadas con KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO foron examinadas por microscopía confocal. A densidade dos filamentos de actina corticais calculouse a partir de micrografías de 25 células independentes. As letras indican diferenzas significativas (proba Tukey HSD, p< 0,05). Barra de escala = 10 µm. (c) Observación de células BY-2 mortas mediante tinguidura con azul Evans. As células BY-2 tratadas con KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO foron examinadas por microscopía de campo claro. n=3. Barra de escala = 100 µm.
O descubrimento e a aplicación de novos produtos naturais levaron a avances significativos en varios aspectos da vida humana, incluíndo a medicina e a agricultura. Realizáronse investigacións históricas para obter compostos útiles a partir de recursos naturais. En particular, os actinomicetos son coñecidos por ser útiles como antibióticos antiparasitarios para os nematodos debido á súa capacidade para producir varios metabolitos secundarios como a avermectina, o composto principal da ivermectina e a bleomicina e os seus derivados, utilizados medicinalmente como axente anticanceríxeno21,22. Do mesmo xeito, descubriuse unha variedade de compostos herbicidas a partir de actinomicetos, algúns dos cales xa se utilizan comercialmente1,23. Polo tanto, a análise de metabolitos de actinomicetos para illar produtos naturais con actividades biolóxicas desexadas considérase unha estratexia eficaz. Neste estudo, descubrimos un novo composto, a cumamonamida, de S. werraensis e sintetizouno con éxito. O ácido ursónico é un intermediario sintético da urbenamida e os seus derivados. Pode causar o enrolamento característico das raíces, presentar unha actividade herbicida de moderada a forte e danar directa ou indirectamente os microtúbulos das plantas. Non obstante, o mecanismo de acción do ácido urmotónico pode diferir do dos inhibidores de microtúbulos existentes, xa que o KAND 11 tamén altera os filamentos de actina e causa a morte celular, o que suxire un mecanismo regulador polo cal o ácido urmotónico e os seus derivados inflúen nunha ampla gama de estruturas do citoesqueleto.
Unha caracterización máis detallada do ácido urbenónico axudará a comprender mellor o seu mecanismo de acción. En particular, o seguinte obxectivo é avaliar a capacidade do ácido ursónico para unirse a microtúbulos reducidos para determinar se o ácido ursónico e os seus derivados actúan directamente sobre os microtúbulos e os despolimerizan, ou se a súa acción resulta na desestabilización dos microtúbulos. Ademais, no caso de que os microtúbulos non sexan un obxectivo directo, identificar o lugar de acción e os obxectivos moleculares do ácido ursónico nas células vexetais axudará a comprender mellor as propiedades dos compostos relacionados e as posibles formas de mellorar a actividade herbicida. O noso ensaio de bioactividade revelou a capacidade citotóxica única do ácido ursónico no crecemento de plantas como Arabidopsis thaliana, o tabaco e a hepática, mentres que nin as células E. coli nin as HeLa se viron afectadas. A pouca ou ningunha toxicidade para as células animais é unha vantaxe dos derivados do ácido ursónico se se desenvolven como herbicidas para o seu uso en campos agrícolas abertos. De feito, dado que os microtúbulos son estruturas comúns nos eucariotas, a súa inhibición selectiva nas plantas é un requisito clave para os herbicidas. Por exemplo, a propizamida, un axente despolimerizante de microtúbulos que se une directamente á tubulina e inhibe a polimerización, úsase como herbicida debido á súa baixa toxicidade para as células animais24. A diferenza da disopiramida, as benzamidas relacionadas teñen diferentes especificidades de diana. Ademais dos microtúbulos das plantas, o RH-4032 ou a benzoxamida tamén inhiben os microtúbulos das células animais ou oomicetos, respectivamente, e a zalilamida úsase como funxicida debido á súa baixa fitotoxicidade25,26,27. O oso recentemente descuberto e os seus derivados presentan citotoxicidade selectiva contra as plantas, pero cómpre sinalar que modificacións adicionais poden alterar a súa especificidade de diana, proporcionando potencialmente derivados adicionais para o control de fungos patóxenos ou oomicetos.
As propiedades únicas do ácido urbenónico e os seus derivados son útiles para o seu desenvolvemento como herbicidas e o seu uso como ferramentas de investigación. A importancia do citoesqueleto no control da forma das células vexetais é amplamente recoñecida. Estudos anteriores demostraron que as plantas desenvolveron mecanismos complexos de organización dos microtúbulos corticais mediante o control da dinámica dos microtúbulos para controlar adecuadamente a morfoxénese. Identificouse un gran número de moléculas responsables da regulación da actividade dos microtúbulos e a investigación relacionada aínda está en curso3,4,28. A nosa comprensión actual da dinámica dos microtúbulos nas células vexetais non explica completamente os mecanismos de organización dos microtúbulos corticais. Por exemplo, aínda que tanto a disopiramida como a orizalina poden despolimerizar os microtúbulos, a disopiramida causa unha grave distorsión das raíces, mentres que a orizalina ten un efecto relativamente leve. Ademais, as mutacións na tubulina, que estabiliza os microtúbulos, tamén causan dextrorrotación nas raíces, mentres que o paclitaxel, que tamén estabiliza a dinámica dos microtúbulos, non o fai. Polo tanto, o estudo e a identificación dos obxectivos moleculares do ácido ursólico debería proporcionar novos coñecementos sobre a regulación dos microtúbulos corticais das plantas. Do mesmo xeito, as futuras comparacións de produtos químicos que son eficaces para promover un crecemento distorsionado, como a disopiramida, e produtos químicos menos eficaces, como a orizalina ou o ácido kumamotorico, proporcionarán pistas sobre como se produce o crecemento distorsionado.
Por outra banda, os rearranxos do citoesqueleto relacionados coa defensa son outra posibilidade para explicar a citotoxicidade do ácido ursónico. A infección dun patóxeno ou a introdución dun elicitor nas células vexetais ás veces provoca a destrución do citoesqueleto e a posterior morte celular29. Por exemplo, informouse de que a criptoxantina derivada de oomicetos altera os microtúbulos e os filamentos de actina antes da morte das células do tabaco, de xeito similar ao que ocorre co tratamento con KAND30,31. As semellanzas entre as respostas de defensa e as respostas celulares inducidas polo ácido ursónico leváronnos á hipótese de que desencadean procesos celulares comúns, aínda que é evidente un efecto máis rápido e forte do ácido ursónico que da criptoxantina. Non obstante, os estudos demostraron que a alteración dos filamentos de actina promove a morte celular espontánea, que non sempre vai acompañada dunha alteración dos microtúbulos29. Ademais, queda por ver se o patóxeno ou o elicitor provocan un crecemento distorsionado das raíces, como fan os derivados do ácido ursónico. Polo tanto, o coñecemento molecular que relaciona as respostas de defensa e o citoesqueleto é un problema atractivo que hai que abordar. Ao aproveitar a presenza de compostos de baixo peso molecular relacionados co ácido ursónico, así como unha gama de derivados con potencias variables, poden ofrecer oportunidades para atacar mecanismos celulares descoñecidos.
En conxunto, o descubrimento e a aplicación de novos compostos que modulan a dinámica dos microtúbulos proporcionarán métodos poderosos para abordar os complexos mecanismos moleculares subxacentes á determinación da forma das células vexetais. Neste contexto, o composto ácido urmotónico desenvolvido recentemente, que afecta aos microtúbulos e aos filamentos de actina e induce a morte celular, pode brindar unha oportunidade para descifrar a conexión entre o control dos microtúbulos e estes outros mecanismos. Polo tanto, a análise química e biolóxica mediante ácido urbenónico axudaranos a comprender os mecanismos reguladores moleculares que controlan o citoesqueleto da planta.
Inocular S. werraensis MK493-CF1 nun matraz Erlenmeyer con deflectores de 500 mL que conteña 110 mL de medio de sementeira composto por galactosa ao 2 % (p/v), pasta Essence ao 2 % (p/v), composición Bacto-soyton ao 1 % (p/v) (Thermo Fisher Scientific, Inc.), extracto de millo ao 0,5 % (p/v) (KOGOSTCH Co., Ltd., Xapón), (NH4)2SO4 ao 0,2 % (p/v) e CaCO3 ao 0,2 % en auga desionizada (pH 7,4 antes da esterilización). Os cultivos de sementeira incubáronse nun axitador rotatorio (180 rpm) a 27 °C durante 2 días. Cultivo de produción mediante fermentación en estado sólido. O cultivo de sementes (7 ml) transferiuse a un matraz K-1 de 500 ml que contiña 40 g de medio de produción composto por 15 g de cebada prensada (MUSO Co., Ltd., Xapón) e 25 g de auga desionizada (pH non axustado antes da esterilización). A fermentación levouse a cabo a 30 °C na escuridade durante 14 días. O material de fermentación extraeuse con 40 ml/frasco de EtOH e centrifugouse (1500 g, 4 °C, 10 min). O sobrenadante do cultivo (60 ml) extraeuse cunha mestura de MeOH/EtOAc ao 10 %. A capa orgánica evaporouse a presión reducida para obter un residuo (59,5 mg), que se someteu a HPLC con elución en gradiente (0–10 minutos: 90 %) nunha columna de fase inversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, DI 10 mm × lonxitude 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutos: 90 % H2O/CH3CN a 70 % H2O/CH3CN (gradiente), 35–45 minutos: 90 % H2O/EtOH, 45–155 minutos: 90 % H2O/EtOH a 100 % EtOH (gradiente (gradiente), 155–200 min: 100 % EtOH) a un caudal de 1,5 ml/min, illouse cumamonamida (1, 36,0 mg) como un po amorfo branco.
Kumamotoamida(1); RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H)), 4,08 (s, 3H); RMN de 13C (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valor calculado: 141,0659, valor medido: 141,0663, IR νmáx 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
As sementes de Columbia (Col-0) obtivéronse do Centro de Recursos Biolóxicos de Arabidopsis (ABRC) con permiso para o seu uso na investigación. As sementes de Col-0 propagáronse e mantivéronse nas nosas condicións de laboratorio e utilizáronse como plantas de Arabidopsis de tipo silvestre. As sementes de Arabidopsis esterilizáronse superficialmente e cultiváronse en medio Murashige e Skoog á metade da súa concentración que contiña un 2 % de sacarosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), un 0,05 % (p/v) de ácido 2-(4-morfolino)etanosulfónico (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) e un 1,5 % de ágar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, a 23 °C e luz constante. As sementes do mutante phs1-1 foron proporcionadas por T. Hashimoto (Instituto de Ciencia e Tecnoloxía de Nara).
As sementes da cepa SR-1 foron proporcionadas por T. Hashimoto (Instituto de Ciencia e Tecnoloxía de Nara) e empregáronse como plantas de tabaco de tipo silvestre. As sementes de tabaco esterilizáronse superficialmente e mergulláronse en auga estéril durante tres noites para promover a xerminación, e despois colocáronse nunha solución á metade da concentración que contiña un 2 % de sacarosa, un 0,05 % (p/v) de MES e un 0,8 % de goma xelana (medio Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige e Skoog) cun pH de 5,7 e incubáronse a 23 °C baixo luz constante.
A cepa Tak-1 foi proporcionada por T. Kohchi (Universidade de Quioto) e empregouse como unidade experimental estándar para o estudo da hepática. A gemma obtívose de plantas cultivadas esterilizadas e logo plantouse en medio Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) que contiña 1 % de sacarosa e 0,3 % de goma xelana e incubouse a 23 °C baixo luz continua.
As células BY-2 do tabaco (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) foron proporcionadas por S. Hasezawa (Universidade de Toquio). As células BY-2 diluíronse 95 veces en medio Linsmeier e Skoog modificado e suplementáronse semanalmente con ácido 2,4-diclorofenoxiacético 32. A suspensión celular mesturouse nun axitador rotatorio a 130 rpm a 27 °C na escuridade. Lavar as células con 10 veces o volume de medio fresco e resuspender no mesmo medio. As liñas celulares transxénicas BY-2 que expresan de forma estable o marcador de microtúbulos TagRFP-TUA6 ou o marcador de filamentos de actina GFP-ABD2 baixo o promotor 35S do virus do mosaico da coliflor xeráronse como se describe 33,34,35. Estas liñas celulares pódense manter e sincronizar empregando procedementos similares aos empregados para a liña celular BY-2 orixinal.
As células HeLa cultiváronse en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) suplementado cun 10 % de soro fetal bovino, 1,2 U/ml de penicilina e 1,2 μg/ml de estreptomicina nunha incubadora a 37 °C con 5 % de CO2.
Todos os experimentos descritos neste manuscrito realizáronse de acordo coas normas e directrices de bioseguridade xaponesas.
Os compostos disolvéronse en dimetilsulfóxido (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) como solucións madre e diluíronse en medio MS para Arabidopsis e tabaco ou en medio Gamborg B5 para hepática. Para o ensaio de inhibición do crecemento das raíces, sementáronse máis de 10 sementes por placa en medio ágar que contiña os compostos indicados ou DMSO. As sementes incubáronse nunha cámara de crecemento durante 7 días. Fotografáronse as plántulas e mediuse a lonxitude das raíces. Para o ensaio de xerminación de Arabidopsis, sementáronse 48 sementes por placa en medio ágar que contiña 200 μM de composto ou DMSO. As sementes de Arabidopsis cultiváronse nunha cámara de crecemento e o número de plántulas xerminadas contouse 7 días despois da xerminación (día). Para o ensaio de xerminación do tabaco, sementáronse 24 sementes por placa en medio ágar que contiña 200 μM de KAND ou DMSO. As sementes de tabaco cultiváronse nunha cámara de crecemento e o número de plántulas xerminadas contouse despois de 14 días. Para o ensaio de inhibición do crecemento da hepática, 9 embrións de cada placa foron sembrados en medio de ágar que contiña as concentracións indicadas de KAND ou DMSO e incubados nunha cámara de crecemento durante 14 días.
Empregáronse mudas tinguidas con 5 mg/ml de ioduro de propidio (PI) para visualizar a organización do meristema radicular. Os sinais de PI observáronse mediante microscopía de fluorescencia cun microscopio láser confocal de varrido TCS SPE (Leica Microsystems).
A tinción histoquímica das raíces con β-glucuronidase (GUS) realizouse segundo o protocolo descrito por Malami e Benfey36. As plántulas fixáronse en acetona ao 90 % durante a noite, tinguíronse con 0,5 mg/ml de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-glucurónico en tampón GUS durante 1 hora e colocáronse nunha solución de cloraldehído hidratada (8 g de hidrato de cloral, 2 ml de auga e 1 ml de glicerol) e observáronse mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial cun microscopio Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Os ángulos das raíces medíronse en mudas de 7 días de idade cultivadas en placas colocadas verticalmente. Mide o ángulo da raíz desde a dirección do vector de gravidade como se describe no paso 6.
A disposición dos microtúbulos corticais observouse segundo o descrito, con pequenas modificacións no protocolo 37. O anticorpo anti-β-tubulina (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) e a IgG anti-rato conxugada con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) empregáronse como anticorpos primarios e secundarios a dilucións 1:1000 e 1:100, respectivamente. As imaxes de fluorescencia adquirironse cun microscopio láser confocal de varrido TCS SPE (Leica Microsystems). Adquirir imaxes Z-stack e crear proxeccións de máxima intensidade segundo as instrucións do fabricante.
O ensaio de proliferación de células HeLa realizouse empregando o kit de reconto celular 8 (Dojindo) segundo as instrucións do fabricante.
O crecemento de E. coli DH5α analizouse medindo a densidade celular en cultivo cun espectrofotómetro a 600 nm (DO600).
A organización do citoesqueleto en células BY-2 transxénicas observouse usando un microscopio de fluorescencia equipado cun dispositivo de dixitalización confocal CSU-X1 (Yokogawa) e unha cámara sCMOS (Zyla, Andor Technology). A densidade do citoesqueleto avaliouse mediante análise de imaxes, que cuantificou a porcentaxe de píxeles do citoesqueleto entre os píxeles citoplasmáticos en imaxes confocais usando o software ImageJ como se describe38,39.
Para detectar a morte celular en células BY-2, incubouse unha alícuota da suspensión celular con azul Evans ao 0,05 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. A tinción selectiva con azul Evans de células mortas depende da extrusión do colorante das células viables pola membrana plasmática intacta40. As células tinguidas observáronse cun microscopio de campo claro (BX53, Olympus).
As células HeLa cultiváronse en DMEM suplementado con FBS ao 10 % nunha incubadora humidificada a 37 °C e CO2 ao 5 %. As células tratáronse con KAND 11 a 100 μM, ácido kumamonámico 6, kumamonamida 1, colcemida (Gibco) a 100 ng/ml ou Nocodmaze (Sigma) a 100 ng/ml durante 6 h a 37 °C. As células fixáronse con MetOH durante 10 min e despois con acetato durante 5 min a temperatura ambiente. As células fixadas incubáronse con anticorpo primario de β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluído en BSA/PBS ao 0,5 % durante 2 horas, laváronse 3 veces con TBST e despois incubáronse con anticorpo de cabra Alexa Fluor. 488 1 hora. – IgG de rato (Thermo Fisher Scientific: A11001) e 15 ng/ml de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluído en BSA/PBS ao 0,5 %. Despois de lavar con TBST tres veces, observáronse as células tinguidas nun microscopio invertido Nikon Eclipse Ti-E. As imaxes capturáronse cunha cámara CCD Hamamatsu ORCA-R2 arrefriada usando o software MetaMorph (Molecular Devices).
Data de publicación: 17 de xuño de 2024