Para eficazmentecontrolar os mosquitose reducir a incidencia das enfermidades que transmiten, necesítanse alternativas estratéxicas, sostibles e respectuosas co medio ambiente aos pesticidas químicos. Avaliamos as fariñas de sementes de certas Brassicaceae (familia Brassica) como fonte de isotiocianatos derivados de plantas producidos por hidrólise encimática de glucosinolatos bioloxicamente inactivos para o seu uso no control do Aedes exipcio (L., 1762). Fariña de sementes cinco veces desgraxadas (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 e Thlaspi arvense: tres tipos principais de inactivación térmica e degradación encimática). Produtos químicos. Para determinar a toxicidade (LC50) do isotiocianato de alilo, isotiocianato de bencilo e 4-hidroxibencilisotiocianato para as larvas de Aedes aegypti a unha exposición de 24 horas = 0,04 g/120 ml dH2O). Valores de LC50 para mostaza, mostaza branca e equiseto. A fariña de sementes foi de 0,05, 0,08 e 0,05 respectivamente en comparación co isotiocianato de alilo (LC50 = 19,35 ppm) e 4. O isotiocianato de hidroxibencilo (LC50 = 55,41 ppm) foi máis tóxico para as larvas ás 24 horas do tratamento que 0,1 g/120 ml dH2O respectivamente. Estes resultados son consistentes coa produción de fariña de sementes de alfalfa. A maior eficiencia dos ésteres bencílicos corresponde aos valores de LC50 calculados. O uso de fariña de sementes pode proporcionar un método eficaz para o control de mosquitos. a eficacia do po de sementes de crucíferas e os seus principais compoñentes químicos contra as larvas de mosquitos e mostra como os compostos naturais do po de sementes de crucíferas poden servir como un larvicida prometedor e respectuoso co medio ambiente para o control de mosquitos.
As enfermidades transmitidas por vectores causadas polos mosquitos Aedes seguen a ser un importante problema de saúde pública mundial. A incidencia das enfermidades transmitidas por mosquitos esténdese xeograficamente1,2,3 e reaparece, o que leva a brotes de enfermidades graves4,5,6,7. A propagación de enfermidades entre humanos e animais (por exemplo, chikungunya, dengue, febre do Val do Rift, febre amarela e virus Zika) non ten precedentes. Só a febre do dengue pon en risco de infección a aproximadamente 3.600 millóns de persoas nos trópicos, cun estimado de 390 millóns de infeccións que se producen anualmente, o que resulta en 6.100-24.300 mortes ao ano8. A reaparición e o brote do virus Zika en América do Sur atraeron a atención mundial debido ao dano cerebral que causa nos nenos nacidos de mulleres infectadas2. Kremer et al.3 predín que a área de distribución xeográfica dos mosquitos Aedes seguirá expandíndose e que, para 2050, a metade da poboación mundial estará en risco de infección por arbovirus transmitidos por mosquitos.
Agás as vacinas recentemente desenvolvidas contra o dengue e a febre amarela, aínda non se desenvolveron vacinas contra a maioría das enfermidades transmitidas por mosquitos9,10,11. As vacinas aínda están dispoñibles en cantidades limitadas e só se usan en ensaios clínicos. O control dos vectores de mosquitos mediante insecticidas sintéticos foi unha estratexia clave para controlar a propagación das enfermidades transmitidas por mosquitos12,13. Aínda que os pesticidas sintéticos son eficaces para matar os mosquitos, o uso continuado de pesticidas sintéticos afecta negativamente aos organismos non obxectivo e contamina o medio ambiente14,15,16. Aínda máis alarmante é a tendencia ao aumento da resistencia dos mosquitos aos insecticidas químicos17,18,19. Estes problemas asociados aos pesticidas aceleraron a busca de alternativas eficaces e respectuosas co medio ambiente para controlar os vectores de enfermidades.
Desenvolvéronse diversas plantas como fontes de fitopesticidas para o control de pragas20,21. As substancias vexetais son xeralmente respectuosas co medio ambiente porque son biodegradables e teñen unha toxicidade baixa ou insignificante para organismos non obxectivo, como mamíferos, peixes e anfibios20,22. Sábese que os preparados de herbas producen unha variedade de compostos bioactivos con diferentes mecanismos de acción para controlar eficazmente as diferentes etapas da vida dos mosquitos23,24,25,26. Os compostos derivados de plantas, como os aceites esenciais e outros ingredientes vexetais activos, chamaron a atención e allanaron o camiño para ferramentas innovadoras para controlar os vectores de mosquitos. Os aceites esenciais, os monoterpenos e os sesquiterpenos actúan como repelentes, disuasorios de alimentación e ovicidas27,28,29,30,31,32,33. Moitos aceites vexetais causan a morte de larvas, pupas e adultos de mosquitos34,35,36, afectando os sistemas nervioso, respiratorio, endócrino e outros sistemas importantes dos insectos37.
Estudos recentes proporcionaron información sobre o uso potencial das plantas de mostaza e as súas sementes como fonte de compostos bioactivos. A fariña de sementes de mostaza probouse como biofumigante38,39,40,41 e utilizouse como emenda do solo para a supresión de herbas daniñas42,43,44 e o control de patóxenos vexetais transmitidos polo solo45,46,47,48,49,50, nutrición vexetal, nematodos41,51, 52, 53, 54 e pragas55, 56, 57, 58, 59, 60. A actividade funxicida destes pos de sementes atribúese a compostos protectores de plantas chamados isotiocianatos38,42,60. Nas plantas, estes compostos protectores almacénanse nas células vexetais en forma de glucosinolatos non bioactivos. Non obstante, cando as plantas resultan danadas pola alimentación de insectos ou a infección por patóxenos, os glucosinolatos son hidrolizados pola mirosinase en isotiocianatos bioactivos55,61. Os isotiocianatos son compostos volátiles que se sabe que teñen actividade antimicrobiana e insecticida de amplo espectro, e a súa estrutura, actividade biolóxica e contido varían moito entre as especies de Brassicaceae42,59,62,63.
Aínda que se sabe que os isotiocianatos derivados da fariña de sementes de mostaza teñen actividade insecticida, faltan datos sobre a actividade biolóxica contra vectores artrópodos importantes desde o punto de vista médico. O noso estudo examinou a actividade larvicida de catro pós de sementes desengorduradas contra os mosquitos Aedes. Larvas de Aedes aegypti. O obxectivo do estudo foi avaliar o seu uso potencial como biopesticidas respectuosos co medio ambiente para o control de mosquitos. Tamén se probaron tres compoñentes químicos principais da fariña de sementes, isotiocianato de alilo (AITC), isotiocianato de bencilo (BITC) e isotiocianato de 4-hidroxibencilo (4-HBITC) para comprobar a actividade biolóxica destes compoñentes químicos nas larvas de mosquitos. Este é o primeiro informe que avalía a eficacia de catro pós de sementes de repolo e os seus principais compoñentes químicos contra as larvas de mosquitos.
As colonias de laboratorio de Aedes aegypti (cepa Rockefeller) mantivéronse a 26 °C, 70 % de humidade relativa (HR) e 10:14 h (fotoperíodo L:D). As femias apareadas aloxáronse en gaiolas de plástico (altura 11 cm e diámetro 9,5 cm) e alimentáronse mediante un sistema de alimentación con biberóns utilizando sangue bovino citratado (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, EUA). A alimentación con sangue realizouse como de costume utilizando un alimentador de membrana multividro (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, EUA) conectado a un tubo de baño de auga circulante (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, EUA) con control de temperatura de 37 °C. Estirouse unha película de Parafilm M na parte inferior de cada cámara de alimentación de vidro (área 154 mm2). Cada alimentador colocouse entón na grella superior que cubría a gaiola que contiña a femia en proceso de apareamento. Engadíronse aproximadamente entre 350 e 400 μl de sangue bovino a un funil alimentador de vidro cunha pipeta Pasteur (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e deixáronse escorrer os vermes adultos durante polo menos unha hora. A continuación, déuselles ás femias preñadas unha solución de sacarosa ao 10 % e deixáronlles poñer ovos en papel de filtro húmido forrado en cuncas de soufflé ultratransparentes individuais (tamaño de 1,25 fl oz, Dart Container Corp., Mason, MI, EUA). Encha a gaiola con auga. Coloque o papel de filtro que contiña os ovos nunha bolsa selada (SC Johnsons, Racine, WI) e gárdeo a 26 °C. Os ovos eclosionaron e criáronse aproximadamente entre 200 e 250 larvas en bandexas de plástico que contiñan unha mestura de comida para coellos (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, EUA) e po de fígado (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, EUA) e filetes de peixe (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Alemaña) nunha proporción de 2:1:1. Nos nosos bioensaios empregáronse larvas de terceiro estadio tardío.
O material de sementes vexetais empregado neste estudo obtívose das seguintes fontes comerciais e gobernamentais: Brassica juncea (mostaza marrón-Pacific Gold) e Brassica juncea (mostaza branca-Ida Gold) da Cooperativa de Agricultores do Noroeste do Pacífico, estado de Washington, EUA; (Garden Cress) de Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, EUA e Thlaspi arvense (Field Pennycress-Elisabeth) do USDA-ARS, Peoria, IL, EUA; Ningunha das sementes empregadas no estudo foi tratada con pesticidas. Todo o material de sementes foi procesado e empregado neste estudo de acordo coa normativa local e nacional e de conformidade con todas as normativas locais, estatais e nacionais pertinentes. Este estudo non examinou variedades de plantas transxénicas.
As sementes de Brassica juncea (PG), alfalfa (Ls), mostaza branca (IG) e Thlaspi arvense (DFP) moéronse ata obter un po fino empregando un muíño ultracentrífugo Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Alemaña) equipado cunha malla de 0,75 mm e un rotor de aceiro inoxidable, 12 dentes e 10 000 rpm (Táboa 1). O po de sementes moído transferiuse a un dedal de papel e desgrasouse con hexano nun aparato Soxhlet durante 24 h. Unha submostra de mostaza de campo desgrasada tratouse termicamente a 100 °C durante 1 h para desnaturalizar a mirosinase e evitar a hidrólise de glucosinolatos para formar isotiocianatos bioloxicamente activos. O po de sementes de cola de cabalo tratado termicamente (DFP-HT) utilizouse como control negativo desnaturalizando a mirosinase.
O contido de glucosinolato da fariña de sementes desengordurada determinouse por triplicado mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) segundo un protocolo publicado previamente 64. En resumo, engadíronse 3 mL de metanol a unha mostra de 250 mg de po de sementes desengorduradas. Cada mostra sonicouse nun baño de auga durante 30 minutos e deixouse na escuridade a 23 °C durante 16 horas. Despois, filtrouse unha alícuota de 1 mL da capa orgánica a través dun filtro de 0,45 μm nun mostrador automático. Funcionando nun sistema HPLC Shimadzu (dúas bombas LC 20AD; mostrador automático SIL 20A; desgasificador DGU 20As; detector UV-VIS SPD-20A para monitorización a 237 nm; e módulo de bus de comunicación CBM-20A), o contido de glucosinolato da fariña de sementes determinouse por triplicado usando o software Shimadzu LC Solution versión 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, EUA). A columna foi unha columna de fase inversa C18 Inertsil (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, EUA). As condicións iniciais da fase móbil axustáronse a 12 % de metanol/88 % de hidróxido de tetrabutilamonio 0,01 M en auga (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) cun caudal de 1 mL/min. Despois da inxección de 15 μl de mostra, as condicións iniciais mantivéronse durante 20 minutos e, a continuación, a proporción de solventes axustouse a 100 % de metanol, cun tempo total de análise da mostra de 65 minutos. Xerouse unha curva estándar (baseada en nM/mAb) mediante dilucións seriadas de estándares de sinapina, glucosinolato e mirosina recentemente preparados (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) para estimar o contido de xofre da fariña de sementes desgraxada. glucosinolatos. As concentracións de glucosinolato nas mostras analizáronse nun Agilent 1100 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA, EUA) empregando a versión OpenLAB CDS ChemStation (C.01.07 SR2 [255]) equipada coa mesma columna e empregando un método descrito previamente. Determináronse as concentracións de glucosinolato; para que sexan comparables entre os sistemas HPLC.
O isotiocianato de alílo (94 %, estable) e o isotiocianato de bencilo (98 %) adquiriuse a Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). O isotiocianato de 4-hidroxibencilo adquiriuse a ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA). Cando se hidrolizan encimaticamente mediante mirosinase, os glucosinolatos, glucosinolatos e glucosinolatos forman isotiocianato de alílo, isotiocianato de bencilo e isotiocianato de 4-hidroxibencilo, respectivamente.
Os bioensaios de laboratorio realizáronse segundo o método de Muturi et al. 32 con modificacións. No estudo empregáronse cinco alimentos de sementes baixos en graxa: DFP, DFP-HT, IG, PG e Ls. Colocáronse vinte larvas nun vaso de precipitados desbotable de tres vías de 400 mL (VWR International, LLC, Radnor, PA, EUA) que contiña 120 mL de auga desionizada (dH2O). Analizáronse sete concentracións de fariña de sementes para determinar a toxicidade larvaria de mosquitos: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 e 0,12 g de fariña de sementes/120 ml de dH2O para a fariña de sementes DFP, DFP-HT, IG e PG. Os bioensaios preliminares indican que a fariña de sementes de Ls desgraxada é máis tóxica que outras catro fariñas de sementes analizadas. Polo tanto, axustamos as sete concentracións de tratamento de fariña de sementes de Ls ás seguintes concentracións: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 e 0,075 g/120 mL dH2O.
Incluíuse un grupo de control sen tratamento (dH20, sen suplemento de fariña de sementes) para avaliar a mortalidade normal dos insectos nas condicións de ensaio. Os bioensaios toxicolóxicos para cada fariña de sementes incluíron tres vasos de precipitados de tres pendentes repetidos (20 larvas de finais do terceiro estadio por vaso), para un total de 108 frascos. Os recipientes tratados almacenáronse a temperatura ambiente (20-21 °C) e rexistrouse a mortalidade larvaria durante 24 e 72 horas de exposición continua ás concentracións do tratamento. Se o corpo e os apéndices do mosquito non se moven cando se perforan ou se tocan cunha espátula fina de aceiro inoxidable, as larvas do mosquito considéranse mortas. As larvas mortas adoitan permanecer inmóviles nunha posición dorsal ou ventral no fondo do recipiente ou na superficie da auga. O experimento repetiuse tres veces en días diferentes utilizando diferentes grupos de larvas, para un total de 180 larvas expostas a cada concentración de tratamento.
A toxicidade do AITC, BITC e 4-HBITC para as larvas de mosquito avaliouse empregando o mesmo procedemento de bioensaio pero con tratamentos diferentes. Preparense solucións patrón de 100.000 ppm para cada produto químico engadindo 100 µL do produto químico a 900 µL de etanol absoluto nun tubo de centrífuga de 2 ml e axitando durante 30 segundos para mesturar ben. As concentracións do tratamento determináronse en función dos nosos bioensaios preliminares, que descubriron que o BITC era moito máis tóxico que o AITC e o 4-HBITC. Para determinar a toxicidade, usáronse 5 concentracións de BITC (1, 3, 6, 9 e 12 ppm), 7 concentracións de AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 e 35 ppm) e 6 concentracións de 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 e 35 ppm). 30, 45, 60, 75 e 90 ppm). O tratamento de control inxectouse con 108 μL de etanol absoluto, o que equivale ao volume máximo do tratamento químico. Os bioensaios repetíronse como se indicou anteriormente, expondo un total de 180 larvas por concentración de tratamento. A mortalidade larvaria rexistrouse para cada concentración de AITC, BITC e 4-HBITC despois de 24 h de exposición continua.
Realizouse unha análise probit de 65 datos de mortalidade relacionada coa dose empregando o software Polo (Polo Plus, LeOra Software, versión 1.0) para calcular a concentración letal do 50 % (LC50), a concentración letal do 90 % (LC90), a pendente, o coeficiente da dose letal e a concentración letal do 95 %, baseándose en intervalos de confianza para as relacións de doses letais para as curvas de concentración transformadas por logaritmo e dose-mortalidade. Os datos de mortalidade baséanse en datos réplicas combinados de 180 larvas expostas a cada concentración de tratamento. As análises probabilísticas realizáronse por separado para cada fariña de sementes e cada compoñente químico. Con base no intervalo de confianza do 95 % da relación de dose letal, considerouse que a toxicidade da fariña de sementes e os constituíntes químicos para as larvas de mosquito era significativamente diferente, polo que un intervalo de confianza que contiña un valor de 1 non foi significativamente diferente, P = 0,0566.
Os resultados da HPLC para a determinación dos principais glucosinolatos nas fariñas de sementes desgraxadas DFP, IG, PG e Ls indícanse na Táboa 1. Os principais glucosinolatos nas fariñas de sementes analizadas variaron, coa excepción de DFP e PG, que ambas contiñan glucosinolatos de mirosinase. O contido de mirosinina en PG foi maior que en DFP, 33,3 ± 1,5 e 26,5 ± 0,9 mg/g, respectivamente. O po de sementes de Ls contiña 36,6 ± 1,2 mg/g de glucoglicona, mentres que o po de sementes de IG contiña 38,0 ± 0,5 mg/g de sinapina.
As larvas dos mosquitos *Ae. Aedes aegypti* morreron cando se trataron con fariña de sementes desgraxada, aínda que a eficacia do tratamento variou dependendo da especie vexetal. Só o DFP-NT non foi tóxico para as larvas de mosquito despois de 24 e 72 horas de exposición (Táboa 2). A toxicidade do po de sementes activo aumentou co aumento da concentración (Fig. 1A, B). A toxicidade da fariña de sementes para as larvas de mosquito variou significativamente en función do IC do 95 % da relación de dose letal dos valores de CL50 nas avaliacións de 24 horas e 72 horas (Táboa 3). Despois de 24 horas, o efecto tóxico da fariña de sementes de Ls foi maior que o doutros tratamentos con fariña de sementes, coa maior actividade e máxima toxicidade para as larvas (CL50 = 0,04 g/120 ml dH2O). As larvas foron menos sensibles ao DFP ás 24 horas en comparación cos tratamentos con IG, Ls e PG en po de sementes, con valores de CL50 de 0,115, 0,04 e 0,08 g/120 ml dH2O respectivamente, que foron estatisticamente superiores ao valor de CL50 de 0,211 g/120 ml dH2O (Táboa 3). Os valores de CL90 de DFP, IG, PG e Ls foron 0,376, 0,275, 0,137 e 0,074 g/120 ml dH2O, respectivamente (Táboa 2). A concentración máis alta de DPP foi de 0,12 g/120 ml dH2O. Despois de 24 horas de avaliación, a mortalidade larvaria media foi só do 12 %, mentres que a mortalidade media das larvas de IG e PG alcanzou o 51 % e o 82 %, respectivamente. Despois de 24 horas de avaliación, a mortalidade larvaria media para a concentración máis alta de tratamento con fariña de sementes de Ls (0,075 g/120 ml dH2O) foi do 99 % (Fig. 1A).
As curvas de mortalidade estimáronse a partir da resposta á dose (Probit) das larvas exipcias de Ae. (larvas de 3.º estadio) á concentración de fariña de sementes 24 horas (A) e 72 horas (B) despois do tratamento. A liña punteada representa a CL50 do tratamento con fariña de sementes. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Thlaspi arvense inactivado pola calor, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
Na avaliación ás 72 horas, os valores de CL50 da fariña de sementes DFP, IG e PG foron 0,111, 0,085 e 0,051 g/120 ml dH2O, respectivamente. Case todas as larvas expostas á fariña de sementes Ls morreron despois de 72 horas de exposición, polo que os datos de mortalidade foron inconsistentes coa análise Probit. En comparación con outras fariñas de sementes, as larvas foron menos sensibles ao tratamento con fariña de sementes DFP e tiveron valores de CL50 estatisticamente máis altos (táboas 2 e 3). Despois de 72 horas, os valores de CL50 para os tratamentos con fariña de sementes DFP, IG e PG estimáronse en 0,111, 0,085 e 0,05 g/120 ml dH2O, respectivamente. Despois de 72 horas de avaliación, os valores de CL90 dos pós de sementes DFP, IG e PG foron 0,215, 0,254 e 0,138 g/120 ml dH2O, respectivamente. Tras 72 horas de avaliación, a mortalidade larvaria media para os tratamentos con fariña de sementes DFP, IG e PG a unha concentración máxima de 0,12 g/120 ml dH2O foi do 58 %, 66 % e 96 %, respectivamente (Fig. 1B). Tras unha avaliación de 72 horas, descubriuse que a fariña de sementes PG era máis tóxica que a fariña de sementes IG e DFP.
Os isotiocianatos sintéticos, o isotiocianato de alílo (AITC), o isotiocianato de bencilo (BITC) e o isotiocianato de 4-hidroxibencilo (4-HBITC) poden matar eficazmente as larvas de mosquito. 24 horas despois do tratamento, o BITC era máis tóxico para as larvas, cun valor de CL50 de 5,29 ppm en comparación con 19,35 ppm para o AITC e 55,41 ppm para o 4-HBITC (Táboa 4). En comparación co AITC e o BITC, o 4-HBITC ten unha menor toxicidade e un valor de CL50 máis alto. Existen diferenzas significativas na toxicidade larvaria de mosquito dos dous principais isotiocianatos (Ls e PG) na fariña de sementes máis potente. A toxicidade baseada na razón de dose letal dos valores de CL50 entre AITC, BITC e 4-HBITC mostrou unha diferenza estatística tal que o IC do 95 % da razón de dose letal de CL50 non incluía un valor de 1 (P = 0,05, Táboa 4). Estimouse que as concentracións máis altas tanto de BITC como de AITC mataban o 100 % das larvas analizadas (Figura 2).
As curvas de mortalidade estimáronse a partir da resposta á dose (Probit) de Ae. 24 horas despois do tratamento, as larvas exipcias (larvas de 3.º estadio) alcanzaron concentracións sintéticas de isotiocianato. A liña punteada representa a LC50 para o tratamento con isotiocianato. Isotiocianato de bencilo BITC, isotiocianato de alilo AITC e 4-HBITC.
O uso de biopesticidas vexetais como axentes para o control de vectores de mosquitos leva moito tempo sendo estudado. Moitas plantas producen substancias químicas naturais que teñen actividade insecticida37. Os seus compostos bioactivos ofrecen unha alternativa atractiva aos insecticidas sintéticos con gran potencial no control de pragas, incluídos os mosquitos.
As plantas de mostaza cultívanse polas súas sementes, que se usan como especia e fonte de aceite. Cando se extrae aceite de mostaza das sementes ou cando se extrae para usala como biocombustible,69 o subproduto é fariña de sementes desengordurada. Esta fariña de sementes conserva moitos dos seus compoñentes bioquímicos naturais e encimas hidrolíticos. A toxicidade desta fariña de sementes atribúese á produción de isotiocianatos55,60,61. Os isotiocianatos fórmanse pola hidrólise de glucosinolatos polo encima mirosinase durante a hidratación da fariña de sementes38,55,70 e sábese que teñen efectos funxicidas, bactericidas, nematicidas e insecticidas, así como outras propiedades, incluídos efectos sensoriais químicos e propiedades quimioterapéuticas61,62,70. Varios estudos demostraron que as plantas de mostaza e a fariña de sementes actúan eficazmente como fumigantes contra as pragas do solo e dos alimentos almacenados57,59,71,72. Neste estudo, avaliamos a toxicidade da fariña de catro sementes e os seus tres produtos bioactivos (AITC, BITC e 4-HBITC) para as larvas do mosquito *Aedes*. *Aedes aegypti*. Espérase que engadir fariña de sementes directamente á auga que contén larvas de mosquito active procesos encimáticos que producen isotiocianatos tóxicos para as larvas de mosquito. Esta biotransformación demostrouse en parte pola actividade larvicida observada da fariña de sementes e a perda de actividade insecticida cando a fariña de mostaza anana foi tratada termicamente antes do seu uso. Espérase que o tratamento térmico destrúa os encimas hidrolíticos que activan os glucosinolatos, evitando así a formación de isotiocianatos bioactivos. Este é o primeiro estudo que confirma as propiedades insecticidas do po de sementes de col contra os mosquitos nun ambiente acuático.
Entre os pos de sementes analizados, o po de sementes de agrión (Ls) foi o máis tóxico, causando unha alta mortalidade de *Aedes albopictus*. As larvas de *Aedes aegypti* procesáronse continuamente durante 24 horas. Os tres pos de sementes restantes (PG, IG e DFP) tiveron unha actividade máis lenta e aínda causaron unha mortalidade significativa despois de 72 horas de tratamento continuo. Só a fariña de sementes de Ls contiña cantidades significativas de glucosinolatos, mentres que a PG e a DFP contiñan mirosinase e a IG contiña glucosinolato como principal glucosinolato (Táboa 1). A glucotropeolina hidrolízase a BITC e a sinalbina hidrolízase a 4-HBITC61,62. Os nosos resultados de bioensaio indican que tanto a fariña de sementes de Ls como o BITC sintético son altamente tóxicos para as larvas de mosquito. O compoñente principal da fariña de sementes de PG e DFP é o glucosinolato de mirosinase, que se hidroliza a AITC. O AITC é eficaz para matar larvas de mosquito cun valor LC50 de 19,35 ppm. En comparación co AITC e o BITC, o isotiocianato de 4-HBITC é o menos tóxico para as larvas. Aínda que o AITC é menos tóxico que o BITC, os seus valores de CL50 son inferiores aos de moitos aceites esenciais probados en larvas de mosquitos32,73,74,75.
O noso po de sementes de crucíferas para o seu uso contra larvas de mosquitos contén un glucosinolato principal, que representa máis do 98-99 % do total de glucosinolatos segundo a determinación por HPLC. Detectáronse trazas doutros glucosinolatos, pero os seus niveis foron inferiores ao 0,3 % do total de glucosinolatos. O po de sementes de agrión (L. sativum) contén glucosinolatos secundarios (sinigrina), pero a súa proporción é do 1 % do total de glucosinolatos e o seu contido segue sendo insignificante (aproximadamente 0,4 mg/g de po de sementes). Aínda que o PG e o DFP conteñen o mesmo glucosinolato principal (mirosina), a actividade larvicida das súas fariñas de sementes difire significativamente debido aos seus valores de CL50. Varía en toxicidade para o oídio. A aparición de larvas de Aedes aegypti pode deberse a diferenzas na actividade ou estabilidade da mirosinase entre os dous alimentos de sementes. A actividade da mirosinase xoga un papel importante na biodispoñibilidade dos produtos da hidrólise, como os isotiocianatos, nas plantas Brassicaceae76. Informes previos de Pocock et al.77 e Wilkinson et al.78 demostraron que os cambios na actividade e estabilidade da mirosinase tamén poden estar asociados a factores xenéticos e ambientais.
O contido esperado de isotiocianato bioactivo calculouse en función dos valores de CL50 de cada fariña de sementes ás 24 e 72 horas (Táboa 5) para a súa comparación coas aplicacións químicas correspondentes. Despois de 24 horas, os isotiocianatos na fariña de sementes eran máis tóxicos que os compostos puros. Os valores de CL50 calculados en función de partes por millón (ppm) de tratamentos de sementes con isotiocianato foron inferiores aos valores de CL50 para as aplicacións BITC, AITC e 4-HBITC. Observamos larvas consumindo gránulos de fariña de sementes (Figura 3A). En consecuencia, as larvas poden recibir unha exposición máis concentrada a isotiocianatos tóxicos ao inxerir gránulos de fariña de sementes. Isto foi máis evidente nos tratamentos de fariña de sementes IG e PG ás 24 horas de exposición, onde as concentracións de CL50 foron un 75 % e un 72 % inferiores ás dos tratamentos puros con AITC e 4-HBITC, respectivamente. Os tratamentos con Ls e DFP foron máis tóxicos que o isotiocianato puro, con valores de CL50 un 24 % e un 41 % inferiores, respectivamente. As larvas no tratamento de control puparon con éxito (Fig. 3B), mentres que a maioría das larvas no tratamento con fariña de sementes non puparon e o desenvolvemento larvario atrasouse significativamente (Fig. 3B, D). En Spodopteralitura, os isotiocianatos están asociados co atraso do crecemento e o atraso do desenvolvemento79.
As larvas dos mosquitos *Ae. Aedes aegypti* foron expostas continuamente a po de sementes de Brassica durante 24–72 horas. (A) Larvas mortas con partículas de fariña de sementes nas pezas bucais (rodeadas con círculos); (B) O tratamento de control (dH20 sen fariña de sementes engadida) mostra que as larvas medran normalmente e comezan a pupar despois de 72 horas (C, D) Larvas tratadas con fariña de sementes; a fariña de sementes mostrou diferenzas no desenvolvemento e non pupou.
Non estudamos o mecanismo dos efectos tóxicos dos isotiocianatos nas larvas de mosquito. Non obstante, estudos previos en formigas vermellas de lume (Solenopsis invicta) demostraron que a inhibición da glutatión S-transferase (GST) e da esterase (EST) é o principal mecanismo de bioactividade do isotiocianato, e o AITC, mesmo con baixa actividade, tamén pode inhibir a actividade da GST. formigas vermellas de lume importadas en baixas concentracións. A dose é de 0,5 µg/ml80. En contraste, o AITC inhibe a acetilcolinesterase nos gorgojos do millo adultos (Sitophilus zeamais)81. Débense levar a cabo estudos similares para dilucidar o mecanismo da actividade do isotiocianato nas larvas de mosquito.
Empregamos o tratamento con DFP inactivado pola calor para apoiar a proposta de que a hidrólise dos glucosinolatos vexetais para formar isotiocianatos reactivos serve como mecanismo para o control larvario de mosquitos mediante a fariña de sementes de mostaza. A fariña de sementes de DFP-HT non foi tóxica nas taxas de aplicación probadas. Lafarga et al. 82 informaron de que os glucosinolatos son sensibles á degradación a altas temperaturas. Tamén se espera que o tratamento térmico desnaturalice o encima mirosinase na fariña de sementes e impida a hidrólise dos glucosinolatos para formar isotiocianatos reactivos. Isto tamén foi confirmado por Okunade et al. 75 que demostraron que a mirosinase é sensible á temperatura, o que demostra que a actividade da mirosinase se inactivaba completamente cando as sementes de mostaza, mostaza negra e sanguinaria se expoñían a temperaturas superiores a 80 °C. Estes mecanismos poden provocar a perda da actividade insecticida da fariña de sementes de DFP tratada pola calor.
Polo tanto, a fariña de sementes de mostaza e os seus tres isotiocianatos principais son tóxicos para as larvas de mosquitos. Dadas estas diferenzas entre a fariña de sementes e os tratamentos químicos, o uso de fariña de sementes pode ser un método eficaz para o control de mosquitos. É necesario identificar formulacións axeitadas e sistemas de administración eficaces para mellorar a eficacia e a estabilidade do uso de po de sementes. Os nosos resultados indican o uso potencial da fariña de sementes de mostaza como alternativa aos pesticidas sintéticos. Esta tecnoloxía podería converterse nunha ferramenta innovadora para o control dos vectores de mosquitos. Dado que as larvas de mosquitos prosperan en ambientes acuáticos e os glucosinolatos da fariña de sementes convértense encimaticamente en isotiocianatos activos tras a hidratación, o uso de fariña de sementes de mostaza en auga infestada por mosquitos ofrece un potencial de control significativo. Aínda que a actividade larvicida dos isotiocianatos varía (BITC > AITC > 4-HBITC), necesítase máis investigación para determinar se a combinación de fariña de sementes con múltiples glucosinolatos aumenta sinerxicamente a toxicidade. Este é o primeiro estudo que demostra os efectos insecticidas da fariña de sementes de crucíferas desgraxadas e tres isotiocianatos bioactivos nos mosquitos. Os resultados deste estudo abren novos camiños ao demostrar que a fariña de sementes de col desengordurada, un subproduto da extracción de aceite das sementes, pode servir como un axente larvicida prometedor para o control de mosquitos. Esta información pode axudar a promover o descubrimento de axentes de biocontrol vexetal e o seu desenvolvemento como biopesticidas baratos, prácticos e respectuosos co medio ambiente.
Os conxuntos de datos xerados para este estudo e as análises resultantes están dispoñibles a través do autor correspondente se se solicita con razoable solicitude. Ao final do estudo, destruíronse todos os materiais empregados no estudo (insectos e fariña de sementes).
Data de publicación: 29 de xullo de 2024